304 paslanmaz çelik bobin boru kimyasal bileşeni, SPACA6 ektodomain'in yapısı, gamet füzyonu ile ilişkili proteinlerin korunmuş bir süper ailesini içerir.

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Sınırlı CSS desteğine sahip bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Ayrıca sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Slayt başına üç makale gösteren kaydırıcılar.Slaytlar arasında ilerlemek için geri ve ileri düğmelerini veya her slaytta ilerlemek için sondaki slayt denetleyici düğmelerini kullanın.

SPACA6, memelilerin cinsel üremesi sırasında gamet füzyonu için kritik olan, sperm tarafından eksprese edilen bir yüzey proteinidir.Bu temel role rağmen SPACA6'nın spesifik işlevi tam olarak anlaşılamamıştır.SPACA6'nın hücre dışı alanının kristal yapısını 2.2 Å çözünürlükte açıklayarak, dört iplikçikli bir demet ve yarı esnek bağlayıcılarla birleştirilen Ig benzeri β-sandviçlerden oluşan iki alanlı bir proteini ortaya çıkardık.Bu yapı, başka bir gamet füzyonu ile ilişkili protein olan IZUMO1'e benzer ve SPACA6 ve IZUMO1'i, burada IST süper ailesi olarak anılan gübrelemeyle ilişkili proteinlerin süper ailesinin kurucu üyeleri yapar.IST süper ailesi yapısal olarak bükülmüş dört sarmallı demet ve bir çift disülfit bağlı CXXC motifiyle tanımlanır.İnsan proteomunun yapı bazlı AlphaFold araştırması, bu süper ailenin ek protein üyelerini tanımladı;özellikle bu proteinlerin çoğu gamet füzyonunda rol oynar.SPACA6 yapısı ve IST süper ailesinin diğer üyeleriyle olan ilişkisi, memeli gamet füzyonu hakkındaki bilgimizdeki eksik halkayı sağlıyor.
Her insanın yaşamı iki ayrı haploid gametle başlar: babanın spermi ve annenin yumurtası.Bu sperm, milyonlarca sperm hücresinin kadın genital kanalından geçtiği, çeşitli engelleri aştığı1 ve kapasitasyona uğradığı, hareketliliklerini ve yüzey bileşenlerinin sürecini2,3,4 geliştiren yoğun bir seçilim sürecinin galibidir.Sperm ve yumurta birbirini bulsa bile süreç henüz bitmemiştir.Oosit, bir kümülüs hücreleri tabakası ve spermin oosite girmek için içinden geçmesi gereken zona pellucida adı verilen bir glikoprotein bariyeri ile çevrilidir.Spermatozoa, bu son engellerin üstesinden gelmek için yüzey yapışma molekülleri ile membranla ilişkili ve salgılanan enzimlerin bir kombinasyonunu kullanır5.Bu moleküller ve enzimler esas olarak iç zarda ve akrozomal matriste depolanır ve akrozomal reaksiyon6 sırasında spermin dış zarı parçalandığında tespit edilir.Bu yoğun yolculuğun son adımı, iki hücrenin zarlarını birleştirerek tek bir diploid organizma haline geldiği sperm-yumurta füzyonu olayıdır7.Bu süreç insan üremesinde çığır açıcı olmasına rağmen gerekli moleküler etkileşimler tam olarak anlaşılamamıştır.
Gametlerin döllenmesine ek olarak, iki lipit çift katmanının füzyonunun kimyası da kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.Genel olarak membran füzyonu, bir protein katalizörünün iki membranı birbirine yaklaştıran, sürekliliklerini bozan ve füzyona neden olan yapısal bir konformasyon değişikliğine uğramasını gerektiren, enerji açısından elverişsiz bir işlemdir8,9.Bu protein katalizörleri füzojenler olarak bilinir ve sayısız füzyon sisteminde bulunur.Konakçı hücrelere viral giriş (örneğin, HIV-1'de gp160, koronavirüslerde artış, influenza virüslerinde hemaglutinin)10,11,12 plasental (sinsitin)13,14,15 ve alt ökaryotlarda gamet oluşturucu füzyonlar için gereklidirler ( Bitkilerde, protistlerde ve eklembacaklılarda HAP2/GCS1) 16,17,18,19.İnsan gametleri için füzojenler henüz keşfedilmemiştir, ancak bazı proteinlerin gamet bağlanması ve füzyonu için kritik olduğu gösterilmiştir.Fare ve insan gametlerinin füzyonu için gerekli olan bir transmembran proteini olan oositte eksprese edilen CD9, keşfedilen ilk proteindir21,22,23.Kesin işlevi belirsiz kalmasına rağmen, yapışmadaki rolü, yumurta mikrovilluslarındaki yapışma odaklarının yapısı ve/veya oosit yüzey proteinlerinin doğru lokalizasyonu muhtemel görünmektedir 24,25,26.Gamet füzyonu için kritik olan en tipik iki protein, sperm proteini IZUMO127 ve oosit proteini JUNO28'dir ve bunların karşılıklı ilişkisi, füzyon öncesinde gamet tanıma ve yapışmada önemli bir adımdır.Erkek Izumo1 nakavt fareler ve dişi Juno nakavt fareler tamamen sterildir; bu modellerde sperm perivitellin boşluğa girer ancak gametler kaynaşmaz.Benzer şekilde, insan in vitro fertilizasyon deneylerinde gametler anti-IZUMO1 veya JUNO27,29 antikorları ile tedavi edildiğinde birleşme azaldı.
Son zamanlarda, fenotipik olarak IZUMO1 ve JUNO20,30,31,32,33,34,35'e benzer, spermde eksprese edilen proteinlerin yeni keşfedilen bir grubu keşfedilmiştir.Büyük ölçekli bir fare mutagenez çalışmasında sperm akrozomal membranla ilişkili protein 6'nın (SPACA6) döllenme için gerekli olduğu tespit edilmiştir.Transgenin Spaca6 genine eklenmesi, kaynaşmayan spermatozoa üretir, ancak bu spermatozoa perivitellin boşluğuna 36 sızar.Farelerde yapılan daha sonraki nakavt çalışmaları, Gamet füzyonu için Spaca6'nın gerekli olduğunu doğruladı30,32.SPACA6 neredeyse tamamen testislerde eksprese edilir ve IZUMO1'inkine benzer bir lokalizasyon modeline sahiptir, yani akrozomal reaksiyondan önce spermatozoanın intiması içindedir ve daha sonra akrozomal reaksiyondan sonra ekvator bölgesine göç eder30,32.Spaca6 homologları çeşitli memelilerde ve diğer ökaryotlarda mevcuttur (30) ve bunun insan gamet füzyonu açısından önemi, SPACA6'ya (30) direnç yoluyla in vitro insan döllenmesinin engellenmesiyle ortaya konmuştur.IZUMO1 ve JUNO'dan farklı olarak SPACA6'nın yapısı, etkileşimleri ve işlevine ilişkin ayrıntılar belirsizliğini koruyor.
Aile planlaması ve doğurganlık tedavisinde gelecekteki gelişmeler hakkında bilgi sahibi olmamızı sağlayacak insan spermi ve yumurtalarının birleşmesinin altında yatan temel süreci daha iyi anlamak için SPACA6 yapısal ve biyokimyasal çalışmalarını gerçekleştirdik.SPACA6'nın hücre dışı alanının kristal yapısı, dört sarmallı bir demet (4HB) ve yarı esnek bölgelerle bağlanan bir immünoglobulin benzeri (Ig benzeri) alan gösterir.Önceki çalışmalarda tahmin edildiği gibi7,32,37 SPACA6'nın alan yapısı insan IZUMO1'inkine benzer ve iki protein olağandışı bir motifi paylaşıyor: üçgen sarmal yüzeye sahip 4HB ve bir çift disülfit bağlantılı CXXC motifi.IZUMO1 ve SPACA6'nın artık gamet füzyonuyla ilişkili proteinlerin daha büyük, yapısal olarak ilişkili bir süper ailesini tanımlamasını öneriyoruz.Süper aileye özgü özellikleri kullanarak, AlphaFold yapısal insan proteomu için kapsamlı bir araştırma gerçekleştirdik ve bu süper ailenin, gamet füzyonu ve/veya gübrelemede yer alan birkaç üyesi de dahil olmak üzere ek üyelerini belirledik.Artık gamet füzyonuyla ilişkili proteinlerin ortak bir yapısal kıvrımı ve süper ailesi olduğu görülüyor ve yapımız, insan gamet füzyon mekanizmasının bu önemli yönünün moleküler bir haritasını sağlıyor.
SPACA6, bir N-bağlı glikan ve altı varsayılan disülfid bağına sahip tek geçişli bir transmembran proteinidir (Şekil S1a ve S2).Drosophila S2 hücrelerinde insan SPACA6'nın (kalıntılar 27-246) hücre dışı alanını eksprese ettik ve nikel afinitesi, katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak proteini saflaştırdık (Şekil S1b).Saflaştırılmış SPACA6 ektodomain çok stabil ve homojendir.Poligonal ışık saçılımı (SEC-MALS) ile birleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi kullanılarak yapılan analiz, hesaplanan moleküler ağırlığı 26.2 ± 0.5 kDa olan bir tepe ortaya çıkardı (Şekil S1c).Bu, SPACA6 monomerik ektodomain'in boyutuyla tutarlıdır ve saflaştırma sırasında oligomerizasyonun meydana gelmediğini gösterir.Ek olarak, dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi, erime noktası 51.3 °C olan karışık bir a/β yapısını ortaya çıkardı (Şekil S1d,e).CD spektrumunun dekonvolüsyonu, %38,6 a-sarmal ve %15,8 β-sarmallı elemanları ortaya çıkardı (Şekil S1d).
SPACA6 ektodomain, rastgele matris tohumlama38 kullanılarak kristalleştirildi ve sonuçta 2,2 Å çözünürlüğe sahip bir veri seti elde edildi (Tablo 1 ve Şekil S3).Yapı tespiti için parça bazlı moleküler ikame ve SAD fazlama verilerinin bromür maruziyeti ile bir kombinasyonu kullanılarak (Tablo 1 ve Şekil S4), son rafine edilmiş model 27-246 arasındaki kalıntılardan oluşur.Yapının belirlendiği sırada deneysel veya AlphaFold yapıları mevcut değildi.SPACA6 ektodomain 20 Å × 20 Å × 85 Å ölçer, yedi helis ve dokuz β-iplikçikten oluşur ve altı disülfit bağıyla stabilize edilmiş uzun bir üçüncül kata sahiptir (Şekil 1a, b).Asn243 yan zincirinin sonundaki zayıf elektron yoğunluğu, bu tortunun N-bağlı bir glikosilasyon olduğunu gösterir.Yapı iki alandan oluşur: bir N-terminal dört sarmallı demet (4HB) ve aralarında bir ara menteşe bölgesi bulunan bir C-terminal Ig benzeri alan (Şekil 1c).
SPACA6'nın hücre dışı alanının yapısı.SPACA6'nın hücre dışı alanının şerit diyagramı, zincirin N'den C terminaline kadar koyu maviden koyu kırmızıya rengi.Disülfür bağlarında yer alan sisteinler macenta renkte vurgulanmıştır.b SPACA6'nın hücre dışı alanının topolojisi.Şekil 1a'dakiyle aynı renk şemasını kullanın.c SPACA6 hücre dışı alanı.4HB, menteşe ve Ig benzeri alan şerit grafikleri sırasıyla turuncu, yeşil ve mavi renktedir.Katmanlar ölçeğe göre çizilmemiştir.
SPACA6'nın 4HB alanı, antiparalel ve paralel etkileşimler arasında değişen (Şekil 2b) sarmal bir sarmal şeklinde düzenlenmiş (Şekil 2a) dört ana sarmalı (sarmal 1-4) içerir.Küçük bir ek tek dönüşlü sarmal (sarmal 1'), demete dik olarak döşenir ve 1 ve 2 helisli bir üçgen oluşturur. Bu üçgen, 3 ve 4 numaralı helislerin nispeten yoğun istiflenmesinin sarmal bükümlü istiflenmesinde hafifçe deforme olur ( Şekil 2a).
4HB N-terminal şerit tablosu.b Dört sarmaldan oluşan bir demetin üstten görünümü; her sarmal, N terminalinde koyu mavi ve C terminalinde koyu kırmızıyla vurgulanmıştır.c 4HB için yukarıdan aşağıya sarmal çark diyagramı; her bir kalıntı, tek harfli bir amino asit koduyla etiketlenmiş bir daire olarak gösterilir;yalnızca çarkın tepesindeki dört amino asit numaralandırılmıştır.Polar olmayan kalıntılar sarı renkli, polar yüksüz kalıntılar yeşil renkli, pozitif yüklü kalıntılar mavi renkli ve negatif yüklü kalıntılar kırmızı renklidir.d 4HB alanının üçgen yüzleri, 4HB'ler turuncu ve menteşeler yeşil renktedir.Her iki ek de çubuk şeklindeki disülfit bağlarını göstermektedir.
4HB, esas olarak alifatik ve aromatik kalıntılardan oluşan bir iç hidrofobik çekirdek üzerinde yoğunlaşmıştır (Şekil 2c).Çekirdek, Cys41 ve Cys55 arasında, helis 1 ve 2'yi üstte yükseltilmiş bir üçgende birbirine bağlayan bir disülfür bağı içerir (Şekil 2d).Helix 1'deki CXXC motifi ile menteşe bölgesindeki β-firketenin ucunda bulunan başka bir CXXC motifi arasında iki ek disülfit bağı oluşturuldu (Şekil 2d).Bilinmeyen bir işlevi olan konservatif bir arginin kalıntısı (Arg37), 1′, 1 ve 2 sarmallarının oluşturduğu içi boş bir üçgenin içine yerleştirilmiştir. Alifatik karbon atomları Cβ, Cγ ve Cδ Arg37, hidrofobik çekirdek ile etkileşime girer ve guanidin grupları döngüsel olarak hareket eder. Thr32 omurgası ve yan zincir arasındaki etkileşimler yoluyla 1 ′ ve 1 helisleri arasında (Şekil S5a, b).Tyr34, Arg37'nin solvent ile etkileşime girebileceği iki küçük boşluk bırakarak boşluğa doğru uzanır.
Ig benzeri β-sandviç alanları, hidrofobik bir çekirdek (39) aracılığıyla etkileşime giren iki veya daha fazla çok iplikli amfipatik β-tabakanın ortak özelliğini paylaşan proteinlerin büyük bir süper ailesidir. SPACA6'nın C-terminal Ig benzeri alanı aynı yapıya sahiptir. ve iki katmandan oluşur (Şekil S6a).Sayfa 1, dört şeritten (D, F, H ve I şeritleri) oluşan bir β-tabakadır; burada F, H ve I şeritleri anti-paralel bir düzenleme oluşturur ve I ve D şeritleri paralel bir etkileşime girer.Tablo 2 küçük bir anti-paralel çift sarmallı beta yaprağıdır (E ve G iplikçikleri).E zincirinin C terminali ile H zincirinin merkezi (Cys170-Cys226) arasında dahili bir disülfür bağı gözlendi (Şekil S6b).Bu disülfit bağı, immünoglobulin40,41'in β-sandviç alanındaki disülfit bağına benzer.
Dört şeritli β-tabaka tüm uzunluğu boyunca bükülerek şekil ve elektrostatik açıdan farklılık gösteren asimetrik kenarlar oluşturur.Daha ince kenar, SPACA6'da kalan düzensiz ve elektrostatik olarak çeşitli yüzeylere kıyasla öne çıkan düz bir hidrofobik çevresel yüzeydir (Şekil S6b,c).Açıkta kalan omurga karbonil / amino grupları ve polar yan zincirlerden oluşan bir halo, hidrofobik yüzeyi çevreler (Şekil S6c).Daha geniş kenar, hidrofobik çekirdeğin N-terminal kısmını bloke eden ve F zinciri omurgasının açık polar grubu ile üç hidrojen bağı oluşturan başlıklı bir sarmal bölüm ile kaplıdır (Şekil S6d).Bu kenarın C-terminal kısmı kısmen açıkta kalan hidrofobik çekirdeğe sahip büyük bir cep oluşturur.Cep, üç set çift arginin kalıntısı (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ve Arg212-Arg214) ve merkezi bir histidin (His220) (Şekil S6e) nedeniyle pozitif yüklerle çevrilidir.
Menteşe bölgesi, sarmal alan ile Ig benzeri alan arasında, bir antiparalel üç sarmallı β katmanı (A, B ve C iplikleri), küçük bir 310 sarmal ve birkaç uzun rastgele sarmal bölümden oluşan kısa bir bölümdür.(Şekil S7).Menteşe bölgesindeki kovalent ve elektrostatik temaslardan oluşan bir ağ, 4HB ile Ig benzeri alan arasındaki yönelimi stabilize ediyor gibi görünmektedir.Ağ üç bölüme ayrılabilir.İlk kısım, menteşedeki β-saç tokası ile 4HB'deki 1' sarmal arasında bir çift disülfit bağı oluşturan iki CXXC motifini (27CXXC30 ve 139CXXC142) içerir.İkinci kısım, Ig benzeri alan ile menteşe arasındaki elektrostatik etkileşimleri içerir.Menteşedeki Glu132, Ig ​​benzeri alanda Arg233 ve menteşedeki Arg135 ile bir tuz köprüsü oluşturur.Üçüncü kısım, Ig benzeri alan ile menteşe bölgesi arasında kovalent bir bağ içerir.İki disülfit bağı (Cys124-Cys147 ve Cys128-Cys153), menteşe halkasını, Gln131 ile omurga fonksiyonel grubu arasındaki elektrostatik etkileşimlerle stabilize edilen bir bağlayıcıya bağlar ve ilk Ig benzeri alana erişime izin verir.zincir.
SPACA6 ektodomain'in yapısı ve 4HB ve Ig benzeri alanların bireysel yapıları, protein veritabanlarında42 yapısal olarak benzer kayıtları aramak için kullanıldı.Yüksek Dali Z skorlarına, küçük standart sapmalara ve büyük LALI skorlarına (ikincisi yapısal olarak eşdeğer kalıntıların sayısıdır) sahip eşleşmeler belirledik.Tam ektodomain aramasından (Tablo S1) ilk 10 isabetin kabul edilebilir bir Z puanı > 842 olmasına rağmen, yalnızca 4HB veya Ig benzeri alan için yapılan bir arama, bu isabetlerin çoğunun yalnızca β-sandviçlere karşılık geldiğini gösterdi.birçok proteinde bulunan her yerde bulunan bir kat.Dali'deki üç aramanın tümü yalnızca tek bir sonuç döndürdü: IZUMO1.
SPACA6 ve IZUMO1'in yapısal benzerlikleri7,32,37 paylaştığı uzun zamandır öne sürülüyordu.Her ne kadar bu iki gamet füzyonu ile ilişkili proteinin ektodomainleri yalnızca% 21 sekans özdeşliğini paylaşsa da (Şekil S8a), korunmuş bir disülfit bağ modeli ve SPACA6'da tahmin edilen bir C-terminal Ig benzeri alan dahil olmak üzere karmaşık kanıtlar, bir yapı oluşturmak için erken girişimlere izin verdi. IZUMO1'i şablon olarak kullanan bir SPACA6 faresinin homoloji modeli37.Yapımız bu tahminleri doğruluyor ve gerçek benzerlik derecesini gösteriyor.Aslında, SPACA6 ve IZUMO137,43,44 yapıları, bir menteşe bölgesi ile bağlanan benzer 4HB ve Ig benzeri β-sandviç alanlarıyla aynı iki alanlı mimariyi (Şekil S8b) paylaşır (Şekil S8c).
IZUMO1 ve SPACA6 4HB'nin geleneksel spiral demetlerden ortak farklılıkları vardır.Endozomal füzyonda yer alan SNARE protein komplekslerinde bulunanlar gibi tipik 4HB'ler (45,46), merkezi bir eksen (47) etrafında sabit bir eğriliği muhafaza eden eşit aralıklı sarmallara sahiptir. Buna karşılık, hem IZUMO1 hem de SPACA6'daki sarmal alanlar değişken eğrilik ile bozulmuştur ve düzensiz paketleme (Şekil S8d).Muhtemelen 1', 1 ve 2 numaralı sarmalların oluşturduğu üçgenin neden olduğu bükülme, IZUMO1 ve SPACA6'da tutulur ve 1' sarmalındaki aynı CXXC motifiyle stabilize edilir.Bununla birlikte, SPACA6'da bulunan ilave disülfit bağı (yukarıdaki 1 ve 2 numaralı helisleri kovalent olarak bağlayan Cys41 ve Cys55), üçgenin tepesinde daha keskin bir tepe noktası oluşturarak SPACA6'yı IZUMO1'den daha bükülmüş hale getirir ve daha belirgin boşluk üçgenlerine sahiptir.Ayrıca IZUMO1'de SPACA6'da bu boşluğun merkezinde gözlenen Arg37 yoktur.Buna karşılık IZUMO1, alifatik ve aromatik kalıntılardan oluşan daha tipik bir hidrofobik çekirdeğe sahiptir.
IZUMO1, çift sarmallı ve beş sarmallı β-tabaka43'ten oluşan Ig benzeri bir alana sahiptir.IZUMO1'deki ekstra iplik, iplikçikteki omurga hidrojen bağlarını sınırlamak için F ipliğiyle etkileşime giren SPACA6'daki bobinin yerini alır.İlginç bir karşılaştırma noktası, iki proteinin Ig benzeri alanlarının öngörülen yüzey yüküdür.IZUMO1 yüzeyi SPACA6 yüzeyine göre daha negatif yüklüdür.Sperm zarına bakan C terminalinin yakınında ek bir yük bulunur.SPACA6'da aynı bölgeler daha nötr veya pozitif yüklüydü (Şekil S8e).Örneğin SPACA6'daki hidrofobik yüzey (daha ince kenarlar) ve pozitif yüklü çukurlar (daha geniş kenarlar) IZUMO1'de negatif yüklüdür.
IZUMO1 ve SPACA6 arasındaki ilişki ve ikincil yapı elemanları iyi korunmasına rağmen, Ig benzeri alanların yapısal hizalanması, iki alanın birbirine göre genel yönelimlerinde farklı olduğunu gösterdi (Şekil S9).IZUMO1'in spiral demeti β-sandviçinin etrafında kıvrılarak merkezi eksenden yaklaşık 50° açıyla daha önce açıklanan "bumerang" şeklini oluşturur.Buna karşılık SPACA6'daki sarmal kiriş ters yönde yaklaşık 10° eğildi.Bu yönelimlerdeki farklılıklar muhtemelen menteşe bölgesindeki farklılıklardan kaynaklanmaktadır.Birincil dizi seviyesinde, IZUMO1 ve SPACA6, sistein, glisin ve aspartik asit kalıntıları dışında menteşe noktasında çok az dizi benzerliği paylaşır.Sonuç olarak hidrojen bağları ve elektrostatik ağlar tamamen farklıdır.β-tabaka ikincil yapı elemanları IZUMO1 ve SPACA6 tarafından paylaşılmaktadır, ancak IZUMO1'deki zincirler çok daha uzundur ve 310 sarmal (sarmal 5) SPACA6'ya özgüdür.Bu farklılıklar, aksi takdirde benzer olan iki protein için farklı alan yönelimlerine neden olur.
Dali sunucusu araştırmamız, SPACA6 ve IZUMO1'in, protein veri tabanında depolanan ve bu özel 4HB katına sahip olan, deneysel olarak belirlenmiş tek iki yapı olduğunu ortaya çıkardı (Tablo S1).Yakın zamanda DeepMind (Alphabet/Google), proteinlerin 3 boyutlu yapılarını birincil dizilerden doğru bir şekilde tahmin edebilen sinir ağı tabanlı bir sistem olan AlphaFold'u geliştirdi48.SPACA6 yapısını çözmemizden kısa bir süre sonra, insan proteomundaki tüm proteinlerin %98,5'ini kapsayan tahmine dayalı yapı modelleri sağlayan AlphaFold veritabanı yayınlandı48,49.Çözülmüş SPACA6 yapımızı bir arama modeli olarak kullanarak, AlphaFold insan proteomundaki model için yapısal bir homoloji araştırması, SPACA6 ve IZUMO1 ile olası yapısal benzerliklere sahip adayları belirledi.AlphaFold'un SPACA6'yı (Şekil S10a) tahmin etmedeki inanılmaz doğruluğu göz önüne alındığında - özellikle çözümlenmiş yapımızla karşılaştırıldığında 1.1 Å rms ektodomain (Şekil S10b) - tanımlanan SPACA6 eşleşmelerinin muhtemelen doğru olacağından emin olabiliriz.
Daha önce PSI-BLAST, spermle ilişkili diğer üç proteinle birlikte IZUMO1 kümesini araştırıyordu: IZUMO2, IZUMO3 ve IZUMO450.AlphaFold, bu IZUMO ailesi proteinlerinin, Ig benzeri bir alandan yoksun olmasına rağmen, IZUMO1 ile aynı disülfit bağ modeliyle 4HB alanına katlandığını öngördü (Şekil 3a ve S11).IZUMO2 ve IZUMO3'ün IZUMO1'e benzer tek taraflı membran proteinleri olduğu, IZUMO4'ün ise salgılandığı varsayılmaktadır.IZUMO 2, 3 ve 4 proteinlerinin gamet füzyonundaki işlevleri belirlenmemiştir.IZUMO3'ün sperm gelişimi sırasında akrozom biyogenezinde rol oynadığı bilinmektedir51 ve IZUMO proteininin bir kompleks oluşturduğu bulunmuştur50.IZUMO proteinlerinin memelilerde, sürüngenlerde ve amfibilerde korunması, bunların potansiyel fonksiyonunun, DCST1/2, SOF1 ve FIMP gibi bilinen diğer gamet füzyonuyla ilişkili proteinlerinkiyle tutarlı olduğunu ortaya koymaktadır.
Sırasıyla turuncu, yeşil ve mavi renkle vurgulanan 4HB, menteşe ve Ig benzeri alanlarla IST süper ailesinin alan mimarisinin diyagramı.IZUMO4, siyah görünen benzersiz bir C-terminal bölgesine sahiptir.Doğrulanmış ve varsayılan disülfür bağları sırasıyla düz ve noktalı çizgilerle gösterilmiştir.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) ve TMEM95 (AlphaFold) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) panel A ile aynı renk aralığında görüntülenir. Disülfid bağları macenta renkte gösterilir.TMEM95, IZUMO2 ve IZUMO3 transmembran helisleri gösterilmemiştir.
IZUMO proteininden farklı olarak diğer SPACA proteinlerinin (yani SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 ve SPACA9) yapısal olarak SPACA6'dan farklı olduğu düşünülmektedir (Şekil S12).Yalnızca SPACA9 4HB'ye sahiptir, ancak SPACA6 ile aynı paralel-anti-paralel oryantasyona veya aynı disülfit bağına sahip olması beklenmemektedir.Yalnızca SPACA1 benzer bir Ig benzeri alana sahiptir.AlphaFold, SPACA3, SPACA4 ve SPACA5'in SPACA6'dan tamamen farklı bir yapıya sahip olduğunu öngörüyor.İlginçtir ki, SPACA4'ün döllenmede de rol oynadığı bilinmektedir, ancak bu rol SPACA6'dan daha büyük ölçüde sperm ve oosit zona pellucida arasındaki etkileşimi kolaylaştırmaktadır52.
AlphaFold aramamız IZUMO1 ve SPACA6 4HB, TMEM95 için başka bir eşleşme buldu.Tek bir sperm spesifik transmembran proteini olan TMEM95, kesildiğinde erkek fareleri kısır hale getirir32,33.TMEM95'ten yoksun spermatozoa normal morfolojiye, hareketliliğe ve zona pellusidaya nüfuz etme ve yumurta zarına bağlanma yeteneğine sahipti, ancak oosit zarıyla kaynaşamadı.Önceki çalışmalar TMEM95'in IZUMO133 ile yapısal benzerlikler paylaştığını göstermiştir.Aslında, AlphaFold modeli, TMEM95'in, IZUMO1 ve SPACA6 ile aynı çift CXXC motifine ve SPACA6'da bulunan helis 1 ve 2 arasındaki aynı ek disülfür bağına sahip bir 4HB olduğunu doğruladı (Şekil 3a ve S11).TMEM95, Ig benzeri bir alandan yoksun olmasına rağmen, SPACA6 ve IZUMO1 menteşe bölgelerine benzer bir disülfit bağ modeline sahip bir bölgeye sahiptir (Şekil 3b).Bu yazının yayınlandığı sırada, ön baskı sunucusu TMEM95'in yapısını rapor ederek AlphaFold53 sonucunu doğruladı.TMEM95, SPACA6 ve IZUMO1'e çok benzer ve amfibilerde zaten evrimsel olarak korunmuştur (Şekil 4 ve S13).
PSI-BLAST araştırması, bu dizilerin hayat ağacındaki konumunu belirlemek için NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP ve SOF1 veritabanlarını kullandı.Dallanma noktaları arasındaki mesafeler ölçeğe göre gösterilmemiştir.
SPACA6 ve IZUMO1 arasındaki çarpıcı genel yapısal benzerlik, bunların TMEM95 ve IZUMO 2, 3 ve 4 proteinlerini içeren korunmuş bir yapısal süper ailenin kurucu üyeleri olduklarını göstermektedir.bilinen üyeler: IZUMO1, SPACA6 ve TMEM95.Yalnızca birkaç üye Ig benzeri alanlara sahip olduğundan, IST süper ailesinin ayırt edici özelliği, tüm bu proteinler için ortak benzersiz özelliklere sahip olan 4HB alanıdır: 1) Anti-paralel/paralel değişimde düzenlenmiş helezonlarla sarmal 4HB (Şekil 5a), 2) demet, demet içindeki iki sarmal ve üçüncü bir dikey sarmaldan oluşan üçgen bir yüze sahiptir (Şekil anahtar alan (Şekil 5c). Tiyoredoksin benzeri proteinlerde bulunan CXXC motifinin işlev gördüğü bilinmektedir) bir redoks sensörü olarak 54,55,56, IST ailesi üyelerindeki motif ise gamet füzyonunda ERp57 gibi protein disülfid izomerazlarla ilişkilendirilebilir.Roller ilişkilidir57,58.
IST süper ailesinin üyeleri, 4HB alanının üç karakteristik özelliği ile tanımlanır: paralel ve antiparalel yönelim arasında değişen dört sarmal, ba-üçgen sarmal demet yüzleri ve küçük moleküller arasında oluşan yaklaşık bir CXXC çift motifi.) N-terminal sarmalları (turuncu) ve menteşe bölgesi β-firkete (yeşil).
SPACA6 ve IZUMO1 arasındaki benzerlik göz önüne alındığında, SPACA6'nın IZUMO1 veya JUNO'ya bağlanma yeteneği test edildi.Biyokatman interferometrisi (BLI), daha önce IZUMO1 ve JUNO arasındaki etkileşimi ölçmek için kullanılmış olan kinetik bazlı bir bağlanma yöntemidir.Biyotin etiketli sensörün, yüksek konsantrasyonda JUNO analitine sahip bir yem olarak IZUMO1 ile inkübasyonundan sonra, sensör ucuna bağlanan biyomateryalin kalınlığında bağlanmanın neden olduğu bir değişikliği gösteren güçlü bir sinyal tespit edildi (Şekil S14a).Benzer sinyaller (yani JUNO, IZUMO1 analitine karşı yem olarak sensöre bağlanmıştır) (Şekil S14b).SPACA6, sensöre bağlı IZUMO1 veya sensöre bağlı JUNO'ya karşı bir analit olarak kullanıldığında hiçbir sinyal tespit edilmedi (Şekil S14a,b).Bu sinyalin yokluğu, SPACA6'nın hücre dışı alanının, IZUMO1 veya JUNO'nun hücre dışı alanıyla etkileşime girmediğini gösterir.
BLI tahlili, yem proteini üzerindeki serbest lizin kalıntılarının biyotinilasyonuna dayandığından, bu modifikasyon, lizin kalıntılarının etkileşime dahil olması durumunda bağlanmayı önleyebilir.Ek olarak, bağlanmanın sensöre göre oryantasyonu sterik engeller oluşturabilir, bu nedenle rekombinant SPACA6, IZUMO1 ve JUNO ektodomainleri üzerinde geleneksel aşağı çekme analizleri de gerçekleştirildi.Buna rağmen SPACA6, His etiketli IZUMO1 veya His etiketli JUNO (Şekil S14c, d) ile çökelmedi; bu, BLI deneylerinde gözlemlenenle tutarlı bir etkileşim olmadığını gösterir.Pozitif bir kontrol olarak JUNO'nun IZUMO1 etiketli ile etkileşimini doğruladık (Şekil S14e ve S15).
SPACA6 ve IZUMO1 arasındaki yapısal benzerliğe rağmen SPACA6'nın JUNO'ya bağlanamaması şaşırtıcı değil.İnsan IZUMO1'in yüzeyi, üç bölgenin her birinden kalıntılar dahil olmak üzere (çoğu menteşe bölgesinde yer almasına rağmen) JUNO ile etkileşime giren 20'den fazla kalıntıya sahiptir (Şekil S14f).Bu kalıntılardan yalnızca bir tanesi SPACA6'da (Glu70) korunmuştur.Birçok kalıntı ikamesi orijinal biyokimyasal özelliklerini korurken, IZUMO1'deki temel Arg160 kalıntısı, SPACA6'da negatif yüklü Asp148 ile değiştirildi;önceki çalışmalar, IZUMO1'deki Arg160Glu mutasyonunun JUNO43'e bağlanmayı neredeyse tamamen ortadan kaldırdığını göstermiştir.Ek olarak, IZUMO1 ve SPACA6 arasındaki alan oryantasyonu farkı, SPACA6 üzerindeki eşdeğer bölgenin JUNO bağlanma bölgesinin yüzey alanını önemli ölçüde arttırdı (Şekil S14g).
Gamet füzyonu için SPACA6'ya bilinen ihtiyaç ve IZUMO1 ile benzerliğine rağmen, SPACA6'nın eşdeğer bir JUNO bağlama fonksiyonuna sahip olduğu görülmemektedir.Bu nedenle yapısal verilerimizi evrimsel biyolojinin sağladığı önemin kanıtlarıyla birleştirmeye çalıştık.SPACA6 homologlarının dizi hizalaması, ortak yapının memelilerin ötesinde korunduğunu gösterir.Örneğin, uzak akraba amfibilerde bile sistein kalıntıları mevcuttur (Şekil 6a).ConSurf sunucusu kullanılarak 66 sekansın çoklu sekans hizalama tutma verileri SPACA6 yüzeyine eşlendi.Bu tür bir analiz, protein evrimi sırasında hangi kalıntıların korunduğunu gösterebilir ve hangi yüzey bölgelerinin fonksiyonda rol oynadığını gösterebilir.
CLUSTA OMEGA kullanılarak hazırlanan 12 farklı türden SPACA6 ektodomainlerinin dizi hizalaması.ConSurf analizine göre en ihtiyatlı pozisyonlar mavi renkle işaretlenmiştir.Sistein kalıntıları kırmızı renkle vurgulanmıştır.Etki alanı sınırları ve ikincil yapı elemanları hizalamanın üst kısmında gösterilir; burada oklar β-ipliklerini ve dalgalar sarmalları gösterir.Dizileri içeren NCBI Erişim Tanımlayıcıları şunlardır: insan (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapuçin maymunu (Cebus mimic, XP_017359366), at (Equus caballus, XP_023506102), katil balina (Orcinus orca3_23 XP) _032_034) .), koyun (Ovis aries, XP_014955560), fil (Loxodonta africana, XP_010585293), köpek (Canis lupus familyis, XP_025277208), fare (Mus musculus, NP_001156381), Tazmanya canavarı (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), Platypus, 8) , 61_89 ve Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Numaralandırma insan sırasına dayanmaktadır.b Üstte 4HB ve altta Ig benzeri alanla SPACA6 yapısının yüzey temsili, renkler ConSurf sunucusundan alınan koruma tahminlerine dayanmaktadır.En iyi korunmuş kısımlar mavi, orta derecede korunmuş kısımlar beyaz, en az korunmuş kısımlar ise sarı renktedir.mor sistein.Yüksek düzeyde koruma gösteren üç yüzey yaması, ek etiketli yamalar 1, 2 ve 3'te gösterilmektedir. Sağ üstteki ekte bir 4HB karikatürü gösterilmektedir (aynı renk şeması).
SPACA6 yapısı yüksek oranda korunmuş üç yüzey bölgesine sahiptir (Şekil 6b).Yama 1, 4HB'yi ve menteşe bölgesini kapsar ve iki korunmuş CXXC disülfür köprüsü, bir Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 menteşe ağı (Şekil S7) ve üç korunmuş dış aromatik kalıntı (Phe31, Tyr73, Phe137) içerir.sperm yüzeyinde birkaç pozitif yüklü kalıntıyı temsil eden Ig benzeri alanın daha geniş bir kenarı (Şekil S6e).İlginç bir şekilde bu yama, daha önce SPACA6 30 fonksiyonuna müdahale ettiği gösterilen bir antikor epitopu içeriyor.Bölge 3, menteşeyi ve Ig benzeri alanın bir tarafını kapsar;bu bölge korunmuş prolinleri (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ve dışa bakan polar/yüklü kalıntıları içerir.Şaşırtıcı bir şekilde, 4HB'nin yüzeyindeki kalıntıların çoğu oldukça değişkendir (Şekil 6b), ancak kat SPACA6 homologu boyunca (hidrofobik demet çekirdeğinin muhafazakarlığıyla gösterildiği gibi) ve IST süper ailesinin ötesinde korunmuştur.
Bu, SPACA6'da tespit edilebilen en az ikincil yapı elemanına sahip en küçük bölge olmasına rağmen, birçok menteşe bölgesi kalıntısı (bölge 3 dahil) SPACA6 homologları arasında yüksek oranda korunur; bu, sarmal demet ve β-sandviçinin yönünün bir rol oynadığını gösterebilir.bir muhafazakar olarak.Bununla birlikte, SPACA6 ve IZUMO1'in menteşe bölgesindeki yaygın hidrojen bağları ve elektrostatik ağlara rağmen, IZUMO137,43,44'ün izin verilen çoklu yapılarının hizalanmasında içsel esnekliğin kanıtı görülebilir.Bireysel alanların hizalanması iyi bir şekilde örtüşüyordu, ancak alanların birbirine göre yönelimi merkezi eksenden 50 ° ila 70 ° arasında değişiyordu (Şekil S16).SPACA6'nın çözeltideki konformasyonel dinamiklerini anlamak için SAXS deneyleri yapıldı (Şekil S17a, b).SPACA6 ektodomain'in baştan rekonstrüksiyonu, bir çubuk kristal yapısına uygundu (Şekil S18), ancak Kratky grafiği bir dereceye kadar esneklik gösterdi (Şekil S17b).Bu konformasyon, bağlanmamış proteinin hem kafeste hem de çözeltide bumerang şeklini aldığı IZUMO1 ile çelişmektedir43.
Esnek bölgeyi spesifik olarak tanımlamak için SPACA6'da hidrojen-döteryum değişim kütle spektroskopisi (H-DXMS) gerçekleştirildi ve daha önce IZUMO143'te elde edilen verilerle karşılaştırıldı (Şekil 7a,b).SPACA6, 100.000 saniyelik değişimden sonra yapı boyunca daha yüksek döteryum değişiminin kanıtladığı gibi, IZUMO1'den açıkça daha esnektir.Her iki yapıda da, menteşe bölgesinin C-terminal kısmı, muhtemelen 4HB ve Ig benzeri alanların birbirine göre sınırlı rotasyonuna izin veren yüksek düzeyde bir değişim gösterir.İlginçtir ki, SPACA6 menteşesinin 147CDLPLDCP154 kalıntısından oluşan C-terminal kısmı yüksek oranda korunmuş bir bölge 3'tür (Şekil 6b), bu muhtemelen alanlar arası esnekliğin SPACA6'nın evrimsel olarak korunmuş bir özelliği olduğunu gösterir.Esneklik analizine göre CD termal erime verileri, SPACA6'nın (Tm = 51,2°C) IZUMO1'den (Tm = 62,9°C) daha az stabil olduğunu gösterdi (Şekil S1e ve S19).
SPACA6 ve b IZUMO1'in H-DXMS görüntüleri.Belirtilen zaman noktalarında döteryum değişimi yüzdesi belirlendi.Hidrojen-döteryum değişiminin seviyeleri, maviden (%10) kırmızıya (%90) kadar değişen bir ölçekte renklerle gösterilir.Kara kutular yüksek değişim alanlarını temsil eder.Kristal yapıda gözlenen 4HB, menteşe ve Ig benzeri alanın sınırları birincil dizinin üzerinde gösterilmiştir.10 saniye, 1000 saniye ve 100.000 saniyedeki döteryum değişim seviyeleri, SPACA6 ve IZUMO1'in şeffaf moleküler yüzeyleri üzerine yerleştirilmiş bir şerit grafik üzerinde çizildi.Döteryum değişim düzeyi %50'nin altında olan yapıların kısımları beyaz renktedir.%50 H-DXMS değişiminin üzerindeki alanlar degrade ölçeğinde renklendirilir.
CRISPR/Cas9 ve fare geni nakavt genetik stratejilerinin kullanılması, sperm ve yumurta bağlanması ve füzyonu için önemli olan çeşitli faktörlerin tanımlanmasına yol açmıştır.IZUMO1-JUNO ve CD9 yapısının iyi karakterize edilmiş etkileşiminin yanı sıra, gamet füzyonuyla ilişkili proteinlerin çoğu yapısal ve işlevsel olarak gizemli kalır.SPACA6'nın biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu, döllenme sırasındaki yapışma/füzyon moleküler bulmacasının bir başka parçasıdır.
SPACA6 ve IST süper ailesinin diğer üyelerinin, kuşlar, sürüngenler ve amfibilerin yanı sıra memelilerde de yüksek düzeyde korunmuş olduğu görülüyor;aslında, SPACA6'nın zebra balığının döllenmesi için bile gerekli olduğu düşünülmektedir59. Bu dağılım, DCST134, DCST234, FIMP31 ve SOF132 gibi bilinen diğer gamet füzyonu ile ilişkili proteinlere benzemektedir ve bu faktörlerin HAP2 eksikliği olduğunu düşündürmektedir (aynı zamanda Birçok protistlerin katalitik aktivitesinden sorumlu olan GCS1) proteinleri olarak bilinir., bitkiler ve eklembacaklılar.Döllenmiş füzyon proteinleri 60, 61. SPACA6 ve IZUMO1 arasındaki güçlü yapısal benzerliğe rağmen, bu proteinlerden herhangi birini kodlayan genlerin nakavt edilmesi, erkek farelerde kısırlığa yol açtı; bu da bunların gamet füzyonundaki fonksiyonlarının kopyalanmadığını gösteriyor..Daha genel anlamda, füzyonun yapışma aşaması için gerekli olan bilinen sperm proteinlerinin hiçbiri gereksiz değildir.
SPACA6'nın (ve IST süper ailesinin diğer üyelerinin) oyunlar arası kavşaklara katılıp katılmadığı, önemli proteinleri füzyon noktalarına toplamak için oyun içi ağlar oluşturup oluşturmadığı, hatta belki de yakalanması zor füzojenler olarak hareket edip etmediği açık bir soru olarak kalıyor.HEK293T hücrelerindeki ortak immünopresipitasyon çalışmaları, tam uzunluktaki IZUMO1 ve SPACA632 arasında bir etkileşimi ortaya çıkardı.Bununla birlikte, rekombinant ektodomainlerimiz in vitro etkileşime girmedi, bu da Noda ve ark.her ikisi de yapıda silinmiştir (döllenme için gereksiz olduğu gösterilen IZUMO1'in sitoplazmik kuyruğuna dikkat edin62).Alternatif olarak IZUMO1 ve/veya SPACA6, fizyolojik olarak spesifik konformasyonlar veya diğer proteinleri içeren (bilinen veya henüz keşfedilmemiş) moleküler kompleksler gibi in vitro olarak çoğaltmadığımız spesifik bağlanma ortamlarına ihtiyaç duyabilir.IZUMO1 ektodomain'in spermatozoanın perivitellin boşluktaki yumurtaya bağlanmasına aracılık ettiğine inanılmasına rağmen SPACA6 ektodomain'in amacı belirsizdir.
SPACA6'nın yapısı, protein-protein etkileşimlerinde rol oynayabilecek birçok korunmuş yüzeyi ortaya koymaktadır.CXXC motifinin hemen bitişiğindeki menteşe bölgesinin korunmuş kısmı (yukarıda Yama 1 olarak adlandırılmıştır), genellikle biyomoleküller arasındaki hidrofobik ve π-istiflenme etkileşimleriyle ilişkilendirilen, dışarıya bakan birkaç aromatik kalıntıya sahiptir.Ig benzeri alanın geniş kenarları (bölge 2), yüksek oranda korunmuş Arg ve His kalıntıları ile pozitif yüklü bir oluk oluşturur ve bu bölgeye karşı antikorlar, daha önce gamet füzyonunu 30 engellemek için kullanılmıştır.Antikor, altı arginin kalıntısından üçüne ve yüksek oranda korunmuş His220'ye sahip olan 212RIRPAQLTHRGTFS225 doğrusal epitopunu tanır.Disfonksiyonun bu spesifik kalıntıların mı yoksa tüm bölgenin tıkanmasından mı kaynaklandığı açık değildir.Bu boşluğun β-sandviçinin C terminaline yakın konumu, komşu sperm proteinleriyle cis-etkileşimlerini gösterir, ancak oosit proteinleriyle değil.Ayrıca, oldukça esnek, prolin açısından zengin bir düğümün (bölge 3) menteşe içinde tutulması, bir protein-protein etkileşiminin alanı olabilir veya daha büyük olasılıkla, iki alan arasındaki esnekliğin korunmasına işaret edebilir.Cinsiyet, SPACA6'nın bilinmeyen rolü açısından önemlidir.Gametlerin füzyonu.
SPACA6, Ig benzeri β-sandviçler de dahil olmak üzere hücreler arası yapışma proteinlerinin özelliklerine sahiptir.Pek çok yapışkan protein (örneğin kaderinler, integrinler, adezinler ve IZUMO1), proteinleri hücre zarından çevresel hedeflerine kadar genişleten bir veya daha fazla β-sandviç alanına sahiptir63,64,65.SPACA6'nın Ig benzeri alanı aynı zamanda β-sandviçlerde yaygın olarak bulunan yapışma ve birleşme motifini de içerir: β-sandviçlerin uçlarında mekanik kelepçeler66 olarak bilinen paralel şerit çiftleri.Bu motifin, hücreler arası etkileşimlerde yer alan proteinler için değerli olan kesme kuvvetlerine karşı direnci arttırdığına inanılmaktadır.Ancak adezinlerle olan bu benzerliğe rağmen SPACA6'nın yumurta akı ile etkileşime girdiğine dair herhangi bir kanıt şu anda mevcut değildir.SPACA6 ektodomain, JUNO'ya bağlanamaz ve burada gösterildiği gibi SPACA6'yı eksprese eden HEK293T hücreleri, zona 32'den yoksun oositlerle neredeyse hiç etkileşime girmez.Eğer SPACA6 oyunlar arası bağlar kurarsa, bu etkileşimler translasyon sonrası modifikasyonlar gerektirebilir veya diğer sperm proteinleri tarafından stabilize edilebilir.İkinci hipotezi desteklemek üzere, IZUMO1 eksikliği olan spermatozoa oositlere bağlanır, bu da IZUMO1 dışındaki moleküllerin gamet yapışma adımında (27) yer aldığını gösterir.
Birçok viral, hücresel ve gelişimsel füzyon proteini, füzojen olarak işlevlerini öngören özelliklere sahiptir.Örneğin viral füzyon glikoproteinleri (sınıf I, II ve III), konakçı membrana yerleştirilen proteinin ucunda hidrofobik bir füzyon peptidine veya halkaya sahiptir.IZUMO143'ün hidrofiliklik haritası ve IST süper ailesinin yapısı (belirlenen ve tahmin edilen), görünürde hiçbir hidrofobik füzyon peptidi göstermedi.Dolayısıyla, IST süper ailesindeki herhangi bir protein füzojen olarak işlev görüyorsa, bunu bilinen diğer örneklerden farklı bir şekilde yaparlar.
Sonuç olarak, gamet füzyonuyla ilişkili proteinlerin IST süper ailesinin üyelerinin işlevleri, merak uyandırıcı bir gizem olmaya devam ediyor.Karakterize edilmiş SPACA6 rekombinant molekülümüz ve onun çözülmüş yapısı, bu paylaşılan yapılar arasındaki ilişkiler ve bunların gamet bağlanması ve füzyonundaki rolleri hakkında fikir verecektir.
Tahmin edilen insan SPACA6 ektodomain'e (NCBI erişim numarası NP_001303901.1; kalıntılar 27-246) karşılık gelen DNA dizisi, Drosophila melanogaster S2 hücrelerinde ekspresyon için kodon açısından optimize edildi ve Kozak'ı (Eurofins Genomics) kodlayan diziyle bir gen fragmanı olarak sentezlendi., BiP salgılama sinyali ve karşılık gelen 5' ve 3', bu genin, puromisin (pMT-puro) ile seçim için modifiye edilmiş bir metalotiyonein promotörüne dayalı bir pMT ekspresyon vektörüne ligasyondan bağımsız klonlanması için biter.pMT-puro vektörü, bir trombin bölünme bölgesini ve ardından 10x-His C-terminal etiketini kodlar (Şekil S2).
SPACA6 pMT-puro vektörünün D. melanogaster S2 (Gibco) hücrelerine stabil transfeksiyonu, IZUMO1 ve JUNO43 için kullanılan protokole benzer şekilde gerçekleştirildi.S2 hücreleri eritildi ve %10 (h/h) ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (Gibco) ve 1X antimikotik antibiyotik (Gibco) nihai konsantrasyonuyla desteklenen Schneider ortamında (Gibco) büyütüldü.Erken geçiş hücreleri (3.0 x 106 hücre), 6 oyuklu plakaların (Corning) ayrı ayrı oyuklarına kaplandı.27°C'de 24 saatlik inkübasyonun ardından hücreler, üreticinin protokolüne göre 2 mg SPACA6 pMT-puro vektörü ve Effectene transfeksiyon reaktifinden (Qiagen) oluşan bir karışımla transfekte edildi.Transfekte edilmiş hücreler 72 saat boyunca inkübe edildi ve daha sonra 6 mg/ml puromisin ile toplandı.Hücreler daha sonra tam Schneider ortamından izole edildi ve büyük ölçekli protein üretimi için serumsuz Insect-XPRESS ortamına (Lonza) yerleştirildi.1 L'lik bir S2 hücre kültürü partisi, 2 L'lik havalandırmalı düz tabanlı bir polipropilen Erlenmeyer şişesinde 8-10 x 106 ml-1 hücreye büyütüldü ve daha sonra 500 uM CuS04 (Millipore Sigma) nihai konsantrasyonuyla sterilize edildi ve steril olarak filtrelendi.indüklendi.İndüklenen kültürler 27°C'de 120 rpm'de dört gün boyunca inkübe edildi.
SPACA6 içeren şartlandırılmış ortam, 4°C'de 5660 x g'de santrifüjleme ve ardından 10 kDa MWCO membranlı bir Centramate teğetsel akış filtreleme sistemi (Pall Corp) ile izole edildi.SPACA6 içeren konsantre ortamı 2 ml Ni-NTA agaroz reçinesi (Qiagen) kolonuna uygulayın.Ni-NTA reçinesi, 10 sütun hacmi (CV) tampon A ile yıkandı ve ardından 1 CV tampon A ilave edilerek 50 mM'lik nihai imidazol konsantrasyonu elde edildi.SPACA6, 500 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar imidazol ile desteklenmiş 10 ml tampon A ile elüt edildi.Kısıtlama sınıfı trombin (Millipore Sigma), diyaliz için 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ve 150 mM NaCl'ye (tampon B) karşı mg başına 1 ünite SPACA6 oranında diyaliz tüpüne (MWCO 12-14 kDa) doğrudan eklendi.) 4°C'de 48 saat süreyle.Trombinle parçalanan SPACA6 daha sonra tuz konsantrasyonunu azaltmak için üç kat seyreltildi ve 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ile dengelenmiş 1 ml MonoS 5/50 GL katyon değişim kolonuna (Cytiva/GE) yüklendi.Katyon değiştirici, 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 ile yıkandı, ardından SPACA6, 25 CV için 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 içerisinde 0 ila 500 mM NaCl'den oluşan doğrusal bir gradyanla elüt edildi.İyon değiştirme kromatografisinden sonra SPACA6, 1 ml'ye konsantre edildi ve tampon B ile dengelenmiş bir ENrich SEC650 10 x 300 kolonundan (BioRad) izokratik olarak elüte edildi. Kromatograma göre, SPACA6 içeren havuz ve konsantre fraksiyonları.Saflık, %16 SDS-poliakrilamid jel üzerinde Coomassie lekeli elektroforez ile kontrol edildi.Protein konsantrasyonu, Beer-Lambert yasası ve teorik molar yok olma katsayısı kullanılarak 280 nm'de absorbansla ölçüldü.
Saflaştırılmış SPACA6, gece boyunca 10 mM sodyum fosfat, pH 7,4 ve 150 mM NaF'ye karşı diyaliz edildi ve CD spektroskopisi ile analiz öncesinde 0,16 mg/mL'ye seyreltildi.185 ila 260 nm dalga boyuna sahip CD'lerin spektral taraması, 25°C'de 50 nm/dakika hızında 1 mm optik yol uzunluğuna (Helma) sahip kuvars küvetler kullanılarak bir Jasco J-1500 spektropolarimetre üzerinde toplandı.CD spektrumları taban çizgisiyle düzeltildi, 10 kazanımın ortalaması alındı ​​ve cm2/dmol derece cinsinden ortalama artık eliptikliğe (θMRE) dönüştürüldü:
burada MW, her numunenin Da cinsinden moleküler ağırlığıdır;N, amino asitlerin sayısıdır;θ mili derece cinsinden eliptikliktir;d cm cinsinden optik yolun uzunluğuna karşılık gelir;Birimlerdeki protein konsantrasyonu.