304 Paslanmaz çelik kaynaklı sarmal boru / boru zhemical zomponenti, Küresel Deniz Mikrobiyomunun Biyosentetik Potansiyeli

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Sınırlı CSS desteğine sahip bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Ayrıca sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Slayt başına üç makale gösteren kaydırıcılar.Slaytlar arasında ilerlemek için geri ve ileri düğmelerini veya her slaytta ilerlemek için sondaki slayt denetleyici düğmelerini kullanın.

Detaylı ürün açıklaması

304 Paslanmaz çelik kaynaklı sarmal boru / boru
1. Şartname: Paslanmaz çelik bobin borusu / boruları
2. Tip: kaynaklı veya dikişsiz
3. Standart: ASTM A269, ASTM A249
4. Paslanmaz çelik bobin borusu OD: 6 mm'den 25,4 MM'ye
5. Uzunluk: 600-3500MM veya müşterinin ihtiyacına göre.
6. Duvar kalınlığı: 0,2 mm ila 2,0 mm.

7. Tolerans: Dış Çap: +/-0,01 mm;Kalınlık: +/-%0,01.

8. Bobin iç delik boyutu: 500MM-1500MM (müşteri ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir)

9. Bobin yüksekliği: 200MM-400MM (müşteri ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir)

10. Yüzey: Parlak veya tavlanmış
11. Malzeme: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, alaşım 625, 825, 2205, 2507, vb.
12. Ambalaj: tahta sandık, ahşap palet, ahşap şaft veya müşterinin ihtiyacına göre dokuma çantalar
13. Test: kimyasal bileşen, akma dayanımı, çekme dayanımı, sertlik ölçümü
14. Garanti: Üçüncü taraf (örneğin:SGS TV) denetimi vb.
15. Uygulama: Dekorasyon, mobilya, petrol taşımacılığı, ısı eşanjörü, korkuluk yapımı, kağıt yapımı, otomobil, gıda işleme, tıbbi vb.

Doğal mikrobiyal topluluklar filogenetik ve metabolik olarak çeşitlidir.Yeterince araştırılmamış organizma gruplarına1 ek olarak, bu çeşitlilik aynı zamanda ekolojik ve biyoteknolojik açıdan önemli enzimlerin ve biyokimyasal bileşiklerin2,3 keşfi için de zengin bir potansiyele sahiptir.Bununla birlikte, bu tür bileşikleri sentezleyen ve bunları ilgili konakçılarına bağlayan genomik yolları belirlemek için bu çeşitliliğin incelenmesi hala bir zorluktur.Açık okyanustaki mikroorganizmaların biyosentetik potansiyeli, küresel ölçekte tüm genom çözümleme verilerinin analizindeki sınırlamalar nedeniyle büyük ölçüde bilinmemektedir.Burada, kültürlenmiş hücrelerden ve tek hücrelerden alınan yaklaşık 10.000 mikrobiyal genomu, 1.000'den fazla deniz suyu örneğinden alınan 25.000'den fazla yeni yeniden yapılandırılmış taslak genomla birleştirerek okyanustaki biyosentetik gen kümelerinin çeşitliliğini ve çeşitliliğini araştırıyoruz.Bu çabalar, bazıları daha önce şüphelenilmeyen filogenetik gruplarda bulunan yaklaşık 40.000 varsayılan çoğunlukla yeni biyosentetik gen kümesini tanımladı.Bu popülasyonlarda, işlenmemiş bir bakteri filumuna ait olan ve bu çevredeki biyosentetik olarak en çeşitli mikroorganizmalardan bazılarını içeren, biyosentetik gen kümeleri (“Candidatus Eudormicrobiaceae”) bakımından zenginleştirilmiş bir soy belirledik.Bunlardan sırasıyla olağandışı biyoaktif bileşik yapısı ve enzimoloji örneklerini tanımlayarak fosfataz-peptit ve pitonamid yollarını karakterize ettik.Sonuç olarak, bu çalışma, mikrobiyom temelli stratejilerin, daha önce tanımlanmamış enzimlerin ve doğal gıdaların, yeterince anlaşılmamış bir mikrobiyota ve çevrede araştırılmasına nasıl olanak sağlayabileceğini göstermektedir.
Mikroplar küresel biyojeokimyasal döngüleri yönlendirir, besin ağlarını sürdürür, bitki ve hayvanları sağlıklı tutar5.Muazzam filogenetik, metabolik ve fonksiyonel çeşitlilikleri, doğal ürünler6 dahil olmak üzere yeni taksonların, enzimlerin ve biyokimyasal bileşiklerin keşfi için zengin bir potansiyeli temsil etmektedir.Ekolojik topluluklarda bu moleküller, mikroorganizmalara iletişimden rekabete kadar çeşitli fizyolojik ve ekolojik işlevler sağlar2, 7.Bu doğal ürünler ve genetik olarak kodlanmış üretim yolları, orijinal fonksiyonlarının yanı sıra biyoteknolojik ve terapötik uygulamalara da örnek teşkil etmektedir2,3.Bu tür yolların ve bağlantıların tanımlanması, kültürlenmiş mikropların incelenmesiyle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır.Ancak doğal ortamlar üzerinde yapılan taksonomik çalışmalar, mikroorganizmaların büyük çoğunluğunun yetiştirilmediğini göstermiştir8.Bu kültürel önyargı, birçok mikrop tarafından kodlanan işlevsel çeşitlilikten yararlanma yeteneğimizi sınırlıyor4,9.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son on yıldaki teknolojik gelişmeler, araştırmacıların tüm topluluklardan (metagenomik) veya tek hücrelerden mikrobiyal DNA parçalarını doğrudan (yani önceden kültür olmadan) dizilemelerine olanak tanıdı.Bu parçaları daha büyük genom parçaları halinde bir araya getirme ve metagenomik olarak birleştirilmiş birden fazla genomu (MAG'ler) veya tek çoğaltılmış genomları (SAG'ler) yeniden yapılandırma yeteneği, mikrobiyomun (yani mikrobiyal topluluklar ve mikrobiyom) taksosentrik çalışmaları için önemli bir fırsat açar.yeni yollar aç.belirli bir ortamda kendi genetik materyali) 10,11,12.Aslında, son çalışmalar Dünya üzerindeki mikrobiyal çeşitliliğin filogenetik temsilini büyük ölçüde genişletmiş1, 13 ve daha önce kültürlenmiş mikroorganizma referans genom dizileri (REF'ler)14 tarafından kapsanmayan bireysel mikrobiyal topluluklardaki fonksiyonel çeşitliliğin çoğunu ortaya çıkarmıştır.Keşfedilmemiş fonksiyonel çeşitliliği konakçı genomu bağlamına yerleştirme yeteneği (yani genom çözünürlüğü), muhtemelen yeni doğal ürünleri15,16 kodlayan henüz karakterize edilmemiş mikrobiyal çizgileri tahmin etmek veya bu tür bileşikleri orijinal üreticilerine17 kadar takip etmek için kritik öneme sahiptir.Örneğin, kombine metagenomik ve tek hücreli genomik analiz yaklaşımı, metabolik açıdan zengin süngerle ilişkili bakterilerden oluşan bir grup olan Candidatus Entotheonella'nın çeşitli ilaç potansiyeli üreticileri olarak tanımlanmasına yol açmıştır18.Bununla birlikte, çeşitli mikrobiyal toplulukların genomik araştırmasına yönelik son girişimlere rağmen,16,19 Dünya'nın en büyük ekosistem okyanusuna16,20 ilişkin küresel metagenomik verilerin üçte ikisinden fazlası hala eksik.Bu nedenle genel olarak deniz mikrobiyomunun biyosentetik potansiyeli ve yeni enzimatik ve doğal ürünlerin deposu olma potansiyeli büyük ölçüde yeterince araştırılmamıştır.
Deniz mikrobiyomlarının biyosentetik potansiyelini küresel ölçekte araştırmak için, öncelikle kültüre bağımlı ve kültür dışı yöntemler kullanılarak elde edilen deniz mikrobiyal genomlarını bir araya getirerek filogenetik ve gen fonksiyonuna ilişkin kapsamlı bir veri tabanı oluşturduk.Bu veri tabanının incelenmesi, çoğu henüz karakterize edilmemiş gen kümesi (GCF) ailelerine ait olan çok çeşitli biyosentetik gen kümelerini (BGC'ler) ortaya çıkardı.Ek olarak bugüne kadar açık okyanusta bilinen en yüksek BGC çeşitliliğini sergileyen bilinmeyen bir bakteri ailesi belirledik.Şu anda bilinen yollardan genetik farklılıklarına dayanarak deneysel doğrulama için iki ribozomal sentez ve translasyon sonrası değiştirilmiş peptit (RiPP) yolu seçtik.Bu yolların fonksiyonel karakterizasyonu, beklenmedik enzimoloji örneklerinin yanı sıra proteaz inhibitör aktiviteye sahip yapısal olarak sıra dışı bileşikleri ortaya çıkarmıştır.
İlk başta genom analizi için bakteriyel ve arkal bileşenlere odaklanarak küresel bir veri kaynağı oluşturmayı hedefledik.Bu amaçla, küresel olarak dağıtılmış 215 örnekleme alanından (enlem aralığı = 141,6°) ve birkaç derin katmandan (1 ila 5600 m derinlik, pelajik, mezopelajik ve abisal bölgeleri kapsayan) metagenomik verileri ve 1038 deniz suyu örneğini bir araya getirdik.Arka Plan21,22,23 (Şekil 1a, genişletilmiş veriler, Şekil 1a ve Ek Tablo 1).Geniş bir coğrafi kapsam sağlamanın yanı sıra, seçici olarak filtrelenen bu numuneler, virüs bakımından zengin (<0,2 µm), prokaryotik açıdan zengin (0,2–3 µm), parçacık bakımından zengin (0,8 µm) dahil olmak üzere deniz mikrobiyomunun çeşitli bileşenlerini karşılaştırmamıza olanak sağladı. ).–20 µm) ve virüsü tükenmiş (>0,2 µm) koloniler.
a, Küresel olarak dağılmış 215 konumdan (62°G ila 79°K ve 179°B ila 179°D.) toplanan deniz mikrobiyal topluluklarının halka açık toplam 1038 genomu (metagenomik).Harita döşemeleri © Esri.Kaynaklar: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ ve Esri.b, bu metagenomlar, veri kümelerinde (renkli olarak işaretlenmiş) miktar ve kalite (yöntemler) açısından farklılık gösteren MAG'leri (yöntemler ve ek bilgiler) yeniden yapılandırmak için kullanıldı.Yeniden yapılandırılan MAG'ler, el yapımı MAG26, SAG27 ve REF dahil olmak üzere halka açık (harici) genomlarla desteklendi.27 OMD'yi derleyin.c, yalnızca SAG (GORG)20 veya MAG (GEM)16'ya dayanan önceki raporlarla karşılaştırıldığında, OMD, deniz mikrobiyal topluluklarının genomik karakterizasyonunu (metagenomik okuma haritalama oranı; yöntem), derinlemesine daha tutarlı bir temsille iki ila üç kat geliştirir ve enlem..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD tür kümeleri düzeyinde gruplandırma (%95 ortalama nükleotid kimliği) toplamını tanımlar Yarısından fazlası daha önce GTDB (versiyon 89) e kullanılarak taksonomik açıklamalara göre karakterize edilmemiş yaklaşık 8300 tür, türlerin genom tipine göre sınıflandırılması, MAG, SAG ve REF'lerin filogenetik çeşitliliği yansıtmada birbirlerini iyi tamamladığını gösterdi. deniz mikrobiyomu.Özellikle türlerin %55'i, %26'sı ve %11'i sırasıyla MAG, SAG ve REF'e spesifikti.YARASALAR, Bermuda Atlantik Zaman Serisi;GEM, Dünya'nın mikrobiyomunun genomları;GORG, küresel okyanus referans genomu;SICAK, Hawaii Okyanusu zaman serisi.
Bu veri setini kullanarak, çoğunlukla bakteriyel ve arkal olmak üzere toplam 26.293 MAG'yi yeniden yapılandırdık (Şekil 1b ve genişletilmiş veriler, Şekil 1b).Farklı konumlardan veya zaman noktalarından (yöntemler) alınan örnekler arasındaki doğal dizi varyasyonunun çökmesini önlemek için bu MAG'leri, bir araya getirilmiş metagenomik örneklerden ziyade ayrı ayrı derlemelerden oluşturduk.Ek olarak, genomik parçaları çok sayıda örnekteki (ankete bağlı olarak 58'den 610'a kadar örnek; yöntem) yaygınlık korelasyonlarına göre gruplandırdık.Bunun, birçok büyük ölçekli MAG16, 19, 25 yeniden yapılandırma çalışmasında atlanan, zaman alıcı ancak önemli bir adım24 olduğunu ve yapının miktarını (ortalama 2,7 kat) ve kalitesini (ortalama +%20) önemli ölçüde iyileştirdiğini bulduk. genetik şifre.burada incelenen deniz metagenomundan yeniden yapılandırılmıştır (genişletilmiş veriler, Şekil 2a ve ek bilgiler).Genel olarak bu çabalar, günümüzde mevcut olan en kapsamlı MAG kaynağına kıyasla deniz mikrobiyal MAG'lerinde 4,5 kat artışla sonuçlandı (yalnızca yüksek kaliteli MAG'ler dikkate alınırsa 6 kat).16 (Yöntemler).Bu yeni oluşturulan MAG seti daha sonra özenle seçilmiş 830 MAG26, 5969 SAG27 ve 1707 REF ile birleştirildi.Yirmi yedi deniz bakterisi ve arke türü, 34.799 genomdan oluşan kombinatoryal bir koleksiyon oluşturdu (Şekil 1b).
Daha sonra yeni oluşturulan kaynağı, deniz mikrobiyal topluluklarını temsil etme yeteneğini geliştirmek ve farklı genom türlerini entegre etmenin etkisini değerlendirmek için değerlendirdik.Ortalama olarak, deniz metagenomik verilerinin yaklaşık %40-60'ını (Şekil 1c) kapsadığını bulduk; bu, hem derinlik hem de enlemde daha önceki yalnızca MAG raporlarının iki ila üç katı kadardır. Daha fazla seri 16 veya SAG20.Ek olarak, yerleşik koleksiyonlardaki taksonomik çeşitliliği sistematik olarak ölçmek için, Genom Taksonomi Veritabanı (GTDB) araç setini (yöntemleri) kullanarak tüm genomlara açıklama ekledik ve %95'lik ortalama genom çapında nükleotid kimliği kullandık.28 8.304 tür kümesini (tür) tanımlamak için.Bu türlerin üçte ikisi (yeni sınıflar dahil) daha önce GTDB'de görünmemişti; bunlardan 2790'ı bu çalışmada yeniden yapılandırılan MAG kullanılarak keşfedildi (Şekil 1d).Ek olarak, farklı genom türlerinin oldukça tamamlayıcı olduğunu bulduk: Türlerin sırasıyla %55, %26 ve %11'i tamamen MAG, SAG ve REF'den oluşuyor (Şekil 1e).Ayrıca MAG, su sütununda bulunan 49 türün tamamını kapsıyordu; SAG ve REF ise sırasıyla bunlardan yalnızca 18 ve 11'ini temsil ediyordu.Ancak SAG, Pelagic Bacteriales (SAR11) gibi en yaygın türlerin çeşitliliğini daha iyi temsil eder (genişletilmiş veriler, Şekil 3a), SAG neredeyse 1300 türü ve MAG yalnızca 390 türü kapsar.Özellikle, REF'ler tür düzeyinde MAG'ler veya SAG'larla nadiren örtüşüyordu ve esas olarak diğer izole edilmiş temsili deniz örnekleri (örn. çökeltiler) türleri ile etkileşimler nedeniyle, burada incelenen açık okyanus metagenomik setlerinde bulunmayan yaklaşık 1000 genomun %95'ini temsil ediyordu. .veya ev sahibi-ilişkili).Bilimsel topluluğa geniş çapta erişilebilir hale getirmek için, sınıflandırılmamış parçaları da içeren bu deniz genomu kaynağı (örneğin, tahmin edilen fajlardan, genomik adalardan ve MAG yeniden inşası için yeterli veri bulunmayan genom parçalarından), taksonomik verilerle karşılaştırılabilir. .Okyanus Mikrobiyolojisi Veritabanındaki (OMD; https://microbiomics.io/ocean/) gen işlevi ve bağlamsal parametrelerle birlikte ek açıklamalara erişin.
Daha sonra açık okyanus mikrobiyomlarındaki biyosentetik potansiyelin zenginliğini ve yeniliğini keşfetmeye başladık.Bu amaçla, toplam 39.055 BGC'yi tahmin etmek için ilk olarak 1038 deniz metagenomunda (yöntem) bulunan tüm MAG'ler, SAG'ler ve REF'ler için antiSMASH'i kullandık.Daha sonra bunları, doğal artıklığı (yani, aynı BGC birden fazla genomda kodlanabilir) ve konsantre BGC'lerin metagenomik verileri parçalanmasını hesaba katmak için 6907 yedekli olmayan GCF'ye ve 151 gen kümesi popülasyonuna (GCC'ler; Ek Tablo 2 ve yöntemler) gruplandırdık.Eksik BGC'ler, vakaların% 44 ve% 86'sında en az bir sağlam BGC üyesi içeren, varsa (Ek Bilgiler), sırasıyla GCF'lerin ve GCC'lerin sayısını önemli ölçüde artırmadı.
GCC düzeyinde, tahmin edilen çok çeşitli RiPP'ler ve diğer doğal ürünler bulduk (Şekil 2a).Bunların arasında, örneğin, arilpolienler, karotenoidler, ektoinler ve sideroforlar, geniş bir filogenetik dağılıma ve okyanus metagenomlarında yüksek bir bolluğa sahip GCC'lere aittir; bu, reaktif oksijen türlerine direnç de dahil olmak üzere mikroorganizmaların deniz ortamına geniş bir adaptasyonunu gösterebilir. Oksidatif ve ozmotik stres..veya demir emilimi (daha fazla bilgi).Bu fonksiyonel çeşitlilik, NCBI RefSeq veritabanında (BiG-FAM/RefSeq, bundan sonra RefSeq olarak anılacaktır)29 depolanan yaklaşık 190.000 genom arasında yaklaşık 1,2 milyon BGC'nin yakın zamanda yapılan bir analiziyle çelişmektedir; bu analiz, ribozomal olmayan Sentetaz peptidlerinin (NRPS) ve poliketid sentazın bulunduğunu göstermiştir. (PKS) BGC'ler (Ek Bilgiler).Ayrıca herhangi bir RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0,4; Şekil 2a ve yöntemler) ile yalnızca uzaktan ilişkili 44 (%29) GCC ve yalnızca MAG'de 53 (%35) GCC bulduk, bu da potansiyeli vurguluyor OMD'de daha önce tanımlanmamış kimyasalları tespit etmek için.Bu GCC'lerin her birinin muhtemelen oldukça çeşitli biyosentetik fonksiyonları temsil ettiği göz önüne alındığında, benzer doğal ürünleri29 kodladığı tahmin edilen BGC'lerin daha ayrıntılı bir gruplandırmasını sağlamak amacıyla GCF düzeyindeki verileri daha da analiz ettik.Tanımlanan toplam 3861 (%56) GCF, RefSeq ile örtüşmedi ve GCF'lerin >%97'si, deneysel olarak doğrulanmış BGC'lerin en büyük veritabanlarından biri olan MIBiG'de mevcut değildi (Şekil 2b).Referans genom tarafından iyi temsil edilmeyen ortamlarda birçok potansiyel yeni yol keşfetmek şaşırtıcı olmasa da, kıyaslama öncesinde BGC'leri GCF'lere kopyalama yöntemimiz önceki raporlardan 16 farklıdır ve tarafsız bir yenilik değerlendirmesi sunmamıza olanak tanır.Yeni çeşitliliğin çoğu (3012 GCF veya %78) tahmin edilen terpenlere, RiPP'ye veya diğer doğal ürünlere karşılık gelir ve çoğu (1815 GCF veya %47) biyosentetik potansiyelleri nedeniyle bilinmeyen türlerde kodlanır.PKS ve NRPS kümelerinin aksine, bu kompakt BGC'lerin metagenomik montaj 31 sırasında parçalanma olasılığı daha düşüktür ve ürünlerinin daha fazla zaman ve kaynak yoğun fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir.
Toplam 39.055 BGC, 6.907 GCF ve 151 GCC olarak gruplandırıldı.a, veri gösterimi (dahili harici).53'ü yalnızca MAG tarafından sabitlenen GCC'ye dayalı BGC mesafelerinin hiyerarşik kümelenmesi.GCC, farklı taksonlardan (ln-dönüştürülmüş kapı frekansı) ve farklı BGC sınıflarından (daire boyutu frekansına karşılık gelir) BGC'ler içerir.Her GCC için, dış katman BGC sayısını, prevalansı (örnek yüzdesi) ve BiG-FAM'den BGC'ye olan mesafeyi (minimum BGC kosinüs mesafesi (min(dMIBiG))) temsil eder.Deneysel olarak doğrulanmış BGC'lerle (MIBiG) yakından ilişkili BGC'lere sahip GCC'ler oklarla vurgulanmıştır.b GCF'nin tahmin edilen (BiG-FAM) ve deneysel olarak doğrulanan (MIBiG) BGC'lerle karşılaştırılması sonucunda 3861 yeni (d–>0,2) GCF bulundu.Bunların çoğu (%78) RiPP, terpenler ve diğer varsayılan doğal ürünleri kodluyor.c, 1038 deniz metagenomunda bulunan OMD'deki tüm genomlar, OMD'nin filogenetik kapsamını göstermek için GTDB baz ağacına yerleştirildi.OMD'de herhangi bir genomu olmayan sınıflar gri renkle gösterilmiştir.BGC'lerin sayısı, belirli bir daldaki genom başına tahmin edilen en fazla BGC sayısına karşılık gelir.Açıklık getirmek gerekirse, düğümlerin son %15'i daraltılmıştır.Oklar, Mycobacterium, Gordonia (Rhodococcus'tan sonra ikinci) ve Crocosphaera (Synechococcus'tan sonra ikinci) hariç, BGC açısından zengin (>15 BGC) dalları göstermektedir.d, Bilinmiyor c.Eremiobacterota en yüksek biyosentetik çeşitliliği gösterdi (doğal ürün tipine dayalı Shannon indeksi).Her bant, türdeki en fazla BGC'ye sahip genomu temsil eder.T1PKS, PKS tip I, T2/3PKS, PKS tip II ve tip III.
Zenginlik ve yeniliğin yanı sıra deniz mikrobiyomunun biyosentetik potansiyelinin biyocoğrafik yapısını da araştırıyoruz.Örneklerin ortalama metagenomik GCF kopya numarası dağılımına göre gruplandırılması (Yöntemler), çoğunlukla yüzey veya daha derin güneşli sulardan gelen düşük enlem, yüzey, prokaryotik açısından zengin ve virüs açısından fakir toplulukların RiPP ve BGC terpenleri açısından zengin olduğunu gösterdi.Buna karşılık kutup, derin deniz, virüs ve parçacık bakımından zengin topluluklar, daha yüksek miktarda NRPS ve PKS BGC ile ilişkilendirildi (genişletilmiş veriler, Şekil 4 ve ek bilgiler).Son olarak, iyi çalışılmış tropikal ve pelajik toplulukların yeni terpenlerin en umut verici kaynakları olduğunu bulduk (Artırılmış Veri Şekil).PKS, RiPP ve diğer doğal ürünler için en yüksek potansiyel (genişletilmiş verilerle Şekil 5a).
Deniz mikrobiyomlarının biyosentetik potansiyeline ilişkin çalışmamızı tamamlamak için filogenetik dağılımlarını haritalandırmayı ve BGC ile zenginleştirilmiş yeni dalları tanımlamayı amaçladık.Bu amaçla, deniz mikroplarının genomlarını normalleştirilmiş bir GTDB13 bakteriyel ve arkal filogenetik ağacına yerleştirdik ve kodladıkları varsayılan biyosentetik yolları üst üste koyduk (Şekil 2c).Siyanobakteriler (Synechococcus) ve Tistrella32,33 gibi Proteus bakterileri gibi biyosentetik potansiyelleri ile bilinen deniz suyu örneklerinde (yöntemler) BGC ile zenginleştirilmiş birkaç türü (15'ten fazla BGC ile temsil edilir) kolayca tespit ettik veya yakın zamanda dikkatleri üzerine çektik. doğal ürünler .Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus ve Planctomycetota34,35,36 gibi.İlginç bir şekilde, bu dallarda daha önce keşfedilmemiş birkaç soy bulduk.Örneğin, Planctomycetota ve Myxococcota filumlarındaki en zengin biyosentetik potansiyele sahip türler, sırasıyla karakterize edilmemiş aday takımlara ve cinslere aitti (Ek Tablo 3).Birlikte ele alındığında bu, OMD'nin, enzim ve doğal ürün keşfi için yeni hedefleri temsil edebilecek mikroorganizmalar da dahil olmak üzere daha önce bilinmeyen filogenetik bilgilere erişim sağladığını göstermektedir.
Daha sonra, BGC ile zenginleştirilmiş sınıfı, yalnızca üyeleri tarafından kodlanan maksimum BGC sayısını saymakla kalmayıp, aynı zamanda farklı türdeki doğal aday ürünlerin sıklığını açıklayan bu BGC'lerin çeşitliliğini de değerlendirerek tanımladık (Şekil 2c ve yöntemler). )..Bu çalışmada biyosentetik olarak en çeşitli türlerin özel olarak tasarlanmış bakteriyel MAG'ler tarafından temsil edildiğini bulduk.Bu bakteriler, birkaç genomik çalışma dışında büyük ölçüde keşfedilmemiş olan, işlenmemiş Candidatus Eremiobacterota filumuna aittir37,38.Dikkat çekicidir ki “ca.Eremiobacterota cinsi yalnızca karasal ortamda analiz edilmiştir39 ve BGC açısından zengin herhangi bir üyeyi içerdiği bilinmemektedir.Burada aynı türden sekiz MAG'yi yeniden yapılandırdık (nükleotid kimliği > %99) 23. Bu nedenle, adını Yunan mitolojisinde ve keşif gezilerinde güzel bir hediye olan nereidden (deniz perisi) alan “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii” tür adını öneriyoruz.'Ka.Filogenetik açıklama 13'e göre, E. malaspinii'nin dizi seviyesinin altında önceden bilinen hiçbir akrabası yoktur ve bu nedenle “Ca.Tip tür olarak E. malaspinii” ve “Ca.Eudormicrobiaceae” resmi adıdır (Ek Bilgiler).'Ca'nın kısa metagenomik yeniden inşası.E. malaspinii genom projesi, çok düşük girdi, uzun okuma metagenomik dizilimi ve tek bir numunenin (Yöntemler) 75 kb çoğaltma ile tek bir 9,63 Mb doğrusal kromozom olarak hedeflenen montajı ile doğrulandı.geriye kalan tek belirsizlik olarak.
Bu türün filogenetik bağlamını oluşturmak için, hedeflenen genom yeniden yapılandırması yoluyla Tara Okyanusu keşif gezisinden alınan ökaryotik açıdan zenginleştirilmiş ek metagenomik örneklerde birbiriyle yakından ilişkili 40 tür aradık.Kısaca, metagenomik okumaları "Ca" ile ilişkili genomik parçalara bağladık.E. malaspinii” ve bu örnekte işe alım oranının artmasının diğer akrabaların (yöntemler) varlığını gösterdiğini varsaydı.Sonuç olarak, yeni tanımlanan bir ailedeki (yani “Ca. Eudormicrobiaceae”) üç cinsteki beş türü temsil eden 19 MAG'ın birleşimi olan 10 MAG bulduk.Manuel inceleme ve kalite kontrolünden sonra (genişletilmiş veriler, Şekil 6 ve ek bilgiler), şunu bulduk: “Ca.Eudormicrobiaceae türleri, diğer "Ca" üyelerine göre daha büyük genomlara (8 Mb) ve daha zengin biyosentetik potansiyele (tür başına 14 ila 22 BGC) sahiptir.Clade Eremiobacterota (7 BGC'ye kadar) (Şekil 3a-c).
a, beş 'Ca'nın filogenetik konumları.Eudormicrobiaceae türleri bu çalışmada belirlenen denizel hatlara özgü BGC zenginliği göstermiştir.Filogenetik ağaç tüm 'Ca'ları içerir.MAG Eremiobacterota ve GTDB'de (versiyon 89) sağlanan diğer filumların üyeleri (parantez içindeki genom numaraları) evrimsel arka plan için kullanıldı (Yöntemler).En dıştaki katmanlar aile düzeyindeki (“Ca. Eudormicrobiaceae” ve “Ca. Xenobiaceae”) ve sınıf düzeyindeki (“Ca. Eremiobacteria”) sınıflandırmaları temsil eder.Bu çalışmada açıklanan beş tür, alfasayısal kodlar ve önerilen binom adlarıyla temsil edilmektedir (Ek Bilgiler).b, tamam.Eudormicrobiaceae türleri yedi ortak BGC çekirdeğini paylaşır.A2 sınıfında BGC'nin bulunmaması, temsili MAG'nin eksikliğinden kaynaklanıyordu (Ek Tablo 3).BGC'ler “Ca.Amfitomikrobium” ve “Ca.Amfitomikrobium” (A ve B sınıfları) gösterilmemiştir.c, Tüm BGC’ler “Ca.Eudoremicrobium taraoceanii'nin Tara okyanuslarından alınan 623 metatranskriptomda ifade edildiği bulundu.Düz daireler aktif transkripsiyonu gösterir.Turuncu daireler, temizlik gen ekspresyon oranının (yöntemler) altında ve üstünde log2 ile dönüştürülmüş kat değişikliklerini gösterir.d, 'Ca'yı gösteren göreceli bolluk eğrileri (yöntemler).Eudormicrobiaceae türleri çoğu okyanus havzasında ve tüm su sütununda (yüzeyden en az 4000 m derinliğe kadar) yaygındır.Bu tahminlere dayanarak şunu bulduk: 'Ca.E. malaspinii', derin deniz pelajik tahılla ilişkili topluluklarda prokaryotik hücrelerin %6'sına kadarını oluşturur.Belirli bir derinlik katmanının boyutunun herhangi bir bölümünde bulunan bir türün o alanda mevcut olduğunu kabul ettik.IO – Hint Okyanusu, NAO – Kuzey Atlantik, NPO – Kuzey Pasifik, RS – Kızıldeniz, SAO – Güney Atlantik, SO – Güney Okyanusu, DPT – Güney Pasifik.
Ca'nın bolluğu ve dağılımının incelenmesi.Bulduğumuz gibi, çoğu okyanus havzasında ve tüm su sütununda baskın olan Eudormicrobiaceae (Şekil 3d).Yerel olarak deniz mikrobiyal topluluğunun %6'sını oluştururlar ve bu da onları küresel deniz mikrobiyomunun önemli bir parçası haline getirir.Ek olarak Ca'nın göreceli içeriğini de bulduk.Eudormicrobiaceae türleri ve bunların BGC ekspresyon seviyeleri, ökaryotik zenginleştirilmiş fraksiyonda en yüksekti (Şekil 3c ve genişletilmiş veriler, Şekil 7), bu, plankton da dahil olmak üzere partikül madde ile olası bir etkileşimi gösterir.Bu gözlem 'Ca' ile bazı benzerlikler taşıyor.Bilinen yollar yoluyla sitotoksik doğal ürünler üreten Eudoremicrobium BGC'leri, özellikle Myxococcus41 gibi metabolitler üreten diğer avcılara benzer şekilde yırtıcı davranışlar sergileyebilir (Ek Bilgiler ve Genişletilmiş Veriler, Şekil 8).Ca'nın keşfi.Eudormicrobiaceae'nin daha az mevcut olması (derin okyanus) veya prokaryotik örnekler yerine ökaryotik örnekler, bu bakterilerin ve beklenmedik BGC çeşitliliğinin neden doğal gıda araştırmaları bağlamında belirsiz kaldığını açıklayabilir.
Sonuçta, mikrobiyom temelli çalışmalarımızın yeni yollar, enzimler ve doğal ürünler keşfetme konusundaki vaadini deneysel olarak doğrulamaya çalıştık.Farklı BGC sınıfları arasında, RiPP yolunun, çekirdek peptidin olgun enzimler tarafından çeşitli translasyon sonrası modifikasyonlarına bağlı olarak zengin bir kimyasal ve fonksiyonel çeşitliliği kodladığı bilinmektedir42.Bu yüzden iki 'Ca'yı seçtik.Eudoremicrobium' RiPP BGC'leri (Şekil 3b ve 4a-e), bilinen herhangi bir BGC (\(\bar{d}\)MIBiG ve \(\bar{d}\)RefSeq 0,2'nin üzerinde) ile aynı temele dayanmaktadır.
a – c, Derin deniz Ca türlerine özgü yeni bir (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) RiPP biyosentezi kümesinin in vitro heterolog ekspresyonu ve in vitro enzimatik analizleri.E. malaspinii' difosforile ürünlerin üretimine yol açtı.c, yüksek çözünürlüklü (HR) MS/MS (kimyasal yapıda b ve y iyonları ile gösterilen parçalanma) ve NMR (genişletilmiş veriler, Şekil 9) kullanılarak tanımlanan modifikasyonlar.d, bu fosforile edilmiş peptid, kontrol peptidinde ve dehidre edici peptidde bulunmayan memeli nötrofil elastazının düşük mikromolar inhibisyonunu sergiler (kimyasal gidermenin neden olduğu dehidrasyon).deney üç kere tekrar edildi ve benzer sonuçlara ulaşıldı.Örneğin, ikinci yeni bir \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) protein biyosentezi kümesinin heterolog ifadesi, 46 amino asit çekirdek peptidini değiştiren dört olgun enzimin fonksiyonunu aydınlatır.Kalıntılar, HR-MS/MS, izotop etiketleme ve NMR analizi (Ek Bilgiler) tarafından tahmin edilen modifikasyon bölgesine göre boyanır.Kesikli renklenme, modifikasyonun iki kalıntıdan birinde meydana geldiğini gösterir.Şekil, tüm olgun enzimlerin aynı çekirdek üzerindeki aktivitesini gösteren çok sayıda heterolog yapının bir derlemesidir.h, Omurga amid N-metilasyonu için NMR verilerinin gösterimi.Tam sonuçlar şekil 2'de gösterilmektedir.Genişletilmiş verilerle 10.i, MIBiG 2.0 veri tabanında bulunan tüm FkbM alanları arasında olgun FkbM protein kümesi enziminin Filogenetik konumu, N-metiltransferaz aktivitesine sahip bu ailenin bir enzimini ortaya koymaktadır (Ek Bilgiler).BGC'lerin (a, e), öncü peptid yapılarının (b, f) ve doğal ürünlerin varsayılan kimyasal yapılarının (c, g) şematik diyagramları gösterilmektedir.
İlk RiPP yolu (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) yalnızca derin deniz türlerinde bulundu “Ca.E. malaspinii” ve Peptid öncüsü için kodlar (Şekil 4a, b).Bu olgun enzimde, normalde fosforilasyonu ve ardından 43'ün çıkarılmasını (Ek Bilgiler) katalize eden lantipeptid sentazın dehidrasyon alanına homolog olan tek bir fonksiyonel alan tanımladık.Bu nedenle öncü peptidin modifikasyonunun böyle iki aşamalı bir dehidrasyonu içerdiğini tahmin ediyoruz.Ancak tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) kullanarak polifosforile edilmiş doğrusal bir peptit belirledik (Şekil 4c).Beklenmedik olmasına rağmen, bunun son ürün olduğunu destekleyen birkaç kanıt bulduk: iki farklı heterolog konakçı ve in vitro analizlerde dehidrasyon yok, olgun enzimin katalitik dehidrasyon bölgesinde mutasyona uğramış anahtar kalıntıların tanımlanması.tamamı “Ca” tarafından yeniden inşa edilmiştir.E. malaspinii genomu (genişletilmiş veriler, Şekil 9 ve ek bilgiler) ve son olarak fosforile edilmiş ürünün biyolojik aktivitesi, ancak kimyasal olarak sentezlenmiş dehidre form değil (Şekil 4d).Aslında, ekolojik rolün açıklığa kavuşturulmasına rağmen, konsantrasyon aralığında (IC50 = 14,3 μM) 44 diğer ilgili doğal ürünlerle karşılaştırılabilir şekilde, nötrofil elastaz'a karşı düşük bir mikromolar proteaz inhibitör aktivitesi sergilediğini bulduk.Bu sonuçlara dayanarak yola “fosfettin” adını vermeyi öneriyoruz.
İkinci durum 'Ca'ya özgü karmaşık bir RiPP yoludur.Eudoremicrobium cinsinin (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) doğal protein ürünlerini kodladığı tahmin edildi (Şekil 4e).Bu yollar, nispeten kısa BGC'ler45 tarafından kodlanan enzimler tarafından oluşturulan olağandışı kimyasal modifikasyonların beklenen yoğunluğu ve çeşitliliği nedeniyle biyoteknolojik açıdan özellikle ilgi çekicidir.Bu proteinin, hem poliseramidlerin ana NX5N motifini hem de Landornamidlerin lantiyonin halkasını 46 içermemesi açısından daha önce karakterize edilen proteinlerden farklı olduğunu bulduk.Yaygın heterolog ekspresyon modellerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için bunları, dört olgun yol enzimini (yöntemleri) karakterize etmek üzere özel bir Microvirgula aerodenitrificans sistemi ile birlikte kullandık.MS/MS, izotop etiketleme ve NMR kombinasyonunu kullanarak bu olgun enzimleri peptidin 46 amino asitlik çekirdeğinde tespit ettik (Şekil 4f,g, genişletilmiş veriler, Şekil 10-12 ve ek bilgiler).Olgun enzimler arasında, RiPP yolunda bir FkbM O-metiltransferaz ailesi üyesinin 47 ilk görünümünü tanımladık ve beklenmedik bir şekilde bu olgun enzimin omurga N-metilasyonunu başlattığını bulduk (Şekil 4h, i ve ek bilgiler).Bu modifikasyon doğal NRP48 ürünlerinde bilinmesine rağmen, amid bağlarının enzimatik N-metilasyonu karmaşık ancak biyoteknolojik olarak önemli bir reaksiyon49 olup şimdiye kadar RiPP borozin ailesinin ilgisini çekmiştir.Özgüllük 50,51.Bu aktivitenin diğer enzim ailelerinde ve RiPP'de tanımlanması yeni uygulamalara yol açabilir ve proteinlerin52 fonksiyonel çeşitliliğini ve kimyasal çeşitliliğini genişletebilir.Tanımlanan modifikasyonlara ve önerilen ürün yapısının alışılmadık uzunluğuna dayanarak, "pythonamide" yol adını öneriyoruz.
İşlevsel olarak karakterize edilmiş bir enzim ailesinde beklenmedik bir enzimolojinin keşfi, çevresel genomiğin yeni keşifler için vaat ettiğini ve aynı zamanda yalnızca dizi homolojisine dayalı işlevsel çıkarımların sınırlı kapasitesini ortaya koymaktadır.Bu nedenle, kanonik olmayan biyoaktif polifosforile edilmiş RiPP raporlarıyla birlikte sonuçlarımız, biyokimyasal bileşiklerin işlevsel zenginliğini, çeşitliliğini ve olağandışı yapılarını tam olarak ortaya çıkarmak için kaynak yoğun ancak sentetik biyoloji çabaları açısından kritik değeri göstermektedir.
Burada, mikroplar tarafından kodlanan biyosentetik potansiyelin çeşitliliğini ve bunların küresel deniz mikrobiyomunda genomik bağlamını gösteriyoruz ve ortaya çıkan kaynağı bilim camiasının kullanımına sunarak gelecekteki araştırmaları kolaylaştırıyoruz (https://microbiomics.io/ocean/).Filogenetik ve fonksiyonel yeniliklerinin çoğunun, yalnızca MAG'lerin ve SAG'ların, özellikle de gelecekteki biyo-araştırma çabalarına rehberlik edebilecek, yeterince kullanılmayan mikrobiyal topluluklarda yeniden yapılandırılmasıyla elde edilebileceğini bulduk.Ancak biz burada 'Ca'ya odaklanacağız.Eudormicrobiaceae”nin özellikle biyosentetik olarak “yetenekli” bir soy olduğu düşünüldüğünde, keşfedilmemiş mikrobiyotada tahmin edilen BGC'lerin çoğu muhtemelen çevresel ve/veya biyoteknolojik olarak önemli etkilere sahip bileşikler üreten daha önce tanımlanmamış enzimolojileri kodlamaktadır.
Okyanus havzalarında, derin katmanlarda ve zaman içinde küresel deniz mikrobiyal topluluklarının kapsamını en üst düzeye çıkarmak için yeterli sıralama derinliğine sahip önemli oşinografik ve zaman serisi çalışmalarından elde edilen metagenomik veri kümeleri dahil edildi.Bu veri kümeleri (Ek Tablo 1 ve Şekil 1), Tara okyanuslarında toplanan örneklerden metagenomikleri (viral olarak zenginleştirilmiş, n=190; prokaryotik zenginleştirilmiş, n=180)12,22 ve BioGEOTRACES keşif gezisini (n=480) içerir.Hawaii Okyanus Zaman Serisi (HOT, n = 68), Bermuda-Atlantik Zaman Serisi (BATS, n = 62)21 ve Malaspina Keşif Gezisi (n = 58)23.Tüm metagenomik fragmanlardan sekanslama okumaları, sıralama bağdaştırıcılarını okumalardan çıkararak, kalite kontrol sekanslarıyla (PhiX genomları) eşlenen okumaları kaldırarak ve trimq=14, maq=20 kullanarak kötü okuma kalitesini atarak BBMap (v.38.71) kullanılarak kalite açısından filtrelendi, maxns = 0 ve minlength = 45. Sonraki analizler çalıştırıldı veya belirtilmişse QC okumalarıyla birleştirildi (bbmerge.sh minoverlap=16).MetaSPAdes (gerekiyorsa v.3.11.1 veya v.3.12) kullanılarak derleme yapılmadan önce QC okumaları normalleştirildi (bbnorm.sh hedefi = 40, zihin derinliği = 0).Ortaya çıkan iskele bitişikleri (bundan sonra iskeleler olarak anılacaktır) son olarak uzunluğa (≥1 kb) göre filtrelendi.
1038 metagenomik numune gruplara ayrıldı ve her numune grubu için, tüm numunelerin metagenomik kalite kontrol okumaları her numunenin parantezleriyle ayrı ayrı eşleştirildi, bu da aşağıdaki ikili parantez içindeki grup okumalarının sayısıyla sonuçlandı: Tara Marine Virüsleri – Zenginleştirilmiş (190×190 ), Zenginleştirilmiş Prokaryotlar (180×180), BioGEOTRACES, HOT ve BATS (610×610) ve Malaspina (58×58).Haritalama, okumaların ikincil sitelerle (-a bayrağı kullanılarak) eşleştirilmesine olanak tanıyan Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 kullanılarak yapıldı.Hizalamalar en az 45 baz uzunluğunda olacak, ≥%97 özdeşliğe sahip olacak ve ≥%80 okuma aralığına sahip olacak şekilde filtrelendi.Ortaya çıkan BAM dosyaları, her grup için numune içi ve numuneler arası kapsam sağlamak amacıyla MetaBAT2 (v.2.12.1)55 için jgi_summarize_bam_contig_lengths komut dosyası kullanılarak işlendi.Son olarak, –minContig 2000 ve –maxEdges 500 ile tüm örneklerde MetaBAT2'yi ayrı ayrı çalıştırarak duyarlılığı artırmak için braketler gruplandırıldı. En etkili tek boksör olduğu bağımsız testlerde gösterildiği için toplu boksör yerine MetaBAT2 kullanıyoruz.ve yaygın olarak kullanılan diğer boksörlerden 10 ila 50 kat daha hızlıdır57.Bolluk korelasyonlarının etkisini test etmek için, rastgele seçilmiş bir metagenomik alt örneği (iki Tara Okyanusu veri kümesinin her biri için 10, BioGEOTRACES için 10, her zaman serisi için 5 ve Malaspina için 5) ek olarak yalnızca örnekleri kullandı.Kapsama bilgisi elde etmek için dahili numuneler gruplandırılır.(Ek Bilgiler).
Sonraki analize ek (harici) genomlar dahil edildi; yani Tara Oceans26 veri kümesinin bir alt kümesinden manuel olarak seçilen 830 MAG, GORG20 veri kümesinden 5287 SAG ve 1707 izole REF'den ve MAR veri tabanından (MarDB v. 4) veriler ve 682 SAG) 27. MarDB veri kümesi için, örnek türü aşağıdaki düzenli ifadeyle eşleşiyorsa genomlar mevcut meta verilere göre seçilir: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] izole edildi'.
Her metagenomik kabın ve dış genomların kalitesi, CheckM (v.1.0.13) ve Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59 kullanılarak değerlendirildi.CheckM veya Anvi'o ≥%50 tamlık/tamlık ve ≤%10 kontaminasyon/fazlalık bildirirse metagenomik hücreleri ve harici genomları daha sonraki analiz için kaydedin.Daha sonra bu puanlar, genom kalitesini topluluk kriterlerine60 göre aşağıdaki şekilde sınıflandırmak için ortalama tamlık (mcpl) ve ortalama kontaminasyon (mctn) olarak birleştirildi: yüksek kalite: mcpl ≥ %90 ve mctn ≤ %5;iyi kalite: mcpl ≥ %70, mctn ≤ %10, orta kalite: mcpl ≥ %50 ve mctn ≤ %10, orta kalite: mcpl ≤ %90 veya mctn ≥ %10.Filtrelenen genomlar daha sonra kalite puanlarıyla (Q ve Q') şu şekilde ilişkilendirildi: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (gerilim değişkenliği)/100 + 0,5 x log[N50] .(dRep61'de uygulandı).
Farklı veri kaynakları ve genom tipleri (MAG, SAG ve REF) arasında karşılaştırmalı analize izin vermek için, dRep (v.2.5.4) kullanılarak genom çapında ortalama nükleotit kimliğine (ANI) dayalı olarak 34.799 genomun referansı kaldırıldı.%95 ANI eşiği28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) ile tekrarlar61 ve tür düzeyinde genom kümelenmesini sağlayan SpecI63 kullanan tek kopya işaretleyici genler.Yukarıda tanımlanan ve türü temsil ettiği kabul edilen maksimum kalite puanına (Q') göre her dRep kümesi için temsili bir genom seçildi.
Haritalama hızını değerlendirmek için, OMD'de bulunan 34.799 genomla 1038 metagenomik okuma setinin tamamını haritalamak için BWA (v.0.7.17-r1188, -a) kullanıldı.Kalite kontrollü okumalar tek uçlu modda haritalandı ve elde edilen hizalamalar, yalnızca ≥45 bp uzunluğundaki hizalamaları koruyacak şekilde filtrelendi.ve özdeşlik ≥%95.Her numunenin görüntüleme oranı, filtrelemeden sonra kalan okumaların yüzdesinin toplam kalite kontrol okuma sayısına bölünmesiyle elde edilir.Aynı yaklaşımı kullanarak, 1038 metagenomun her biri 5 milyon eklemeye düşürüldü (genişletilmiş veriler, Şekil 1c) ve OMD'de ve tüm GEM16'da GORG SAG ile eşleştirildi.GEM16 kataloğundaki deniz suyundan geri kazanılan MAG'lerin miktarı, metagenomik kaynakların anahtar kelime sorguları ile deniz suyu örnekleri seçilerek (örneğin deniz çökeltilerinin aksine) belirlendi.Özellikle, "ekosistem_kategorisi" olarak "sucul"u, "ekosistem_tipi" olarak "deniz"i seçiyoruz ve "habitat"ı "derin okyanus", "deniz", "deniz okyanusu", "pelajik deniz", "deniz suyu" olarak filtreliyoruz. “Okyanus”, “Deniz Suyu”, “Yüzey Deniz Suyu”, “Yüzey Deniz Suyu”.Bu, 1823 OTU'ya dağıtılan 5903 MAG (734 yüksek kalite) ile sonuçlandı (görüntüler burada).
Prokaryotik genomlar, GTDB r89 sürüm 13'ü hedefleyen varsayılan parametrelerle GTDB-Tk (v.1.0.2)64 kullanılarak taksonomik olarak açıklanmıştır. Anvi'o, alan tahminine dayalı ökaryotik genomları tanımlamak ve ≥%50 ve artıklık ≤ %10'u geri çağırmak için kullanıldı.Bir türün taksonomik açıklaması, onun temsili genomlarından biri olarak tanımlanır.Ökaryotlar (148 MAG) haricinde, her genom ilk olarak prokka (v.1.14.5)65 kullanılarak işlevsel olarak açıklandı, tam genler adlandırıldı, "arke" veya "bakteri" parametreleri gerektiği gibi tanımlandı; bu, aynı zamanda olmayanlar için de rapor edilmiştir. genleri kodluyor.ve diğer genomik özelliklerin yanı sıra CRISPR bölgeleri.fetchMG (v.1.2)66 kullanarak evrensel tek kopya işaretleyici genleri (uscMG) tanımlayarak tahmin edilen genlere açıklama ekleyin, ortolog grupları atayın ve EggNOG (v.5.0)68'i temel alan emapper (v.2.0.1)67 kullanarak sorgulayın.KEGG veritabanı (10 Şubat 2020'de yayınlandı) 69. Son adım, proteinlerin DIAMOND (v.0.9.30)70 kullanılarak ≥%70 sorgu ve konu kapsamıyla KEGG veritabanıyla eşleştirilmesiyle gerçekleştirildi.Sonuçlar, beklenen maksimum bit hızının (bağlantının kendisi) ≥ %50'si olan bit hızına dayalı olarak NCBI Prokaryotik Genom Annotation Pipeline71'e göre daha fazla filtrelendi.Gen dizileri ayrıca, varsayılan parametreler ve farklı küme patlamaları ile antiSMASH (v.5.1.0)72 kullanılarak genomdaki BGC'leri tanımlamak için girdi olarak kullanıldı.Tüm genomlar ve açıklamalar, web'de bulunan bağlamsal meta verilerle birlikte OMD'de derlenmiştir (https://microbiomics.io/ocean/).
Daha önce tarif edilen yöntemlere benzer şekilde12,22, OMD'deki bakteriyel ve arkal genomlardan >56,6 milyon protein kodlayan genleri %95 özdeşliğe ve daha kısa genlere (%90 kapsam)73 kadar kümelemek için CD-HIT (v.4.8.1) kullandık >17,7 milyon gen kümesi.En uzun dizi, her gen kümesi için temsili gen olarak seçildi.1038 metagenom daha sonra > 17,7 milyon BWA (-a) küme üyesiyle eşleştirildi ve elde edilen BAM dosyaları, yalnızca ≥%95 özdeşlik ve ≥45 temel hizalamalara sahip hizalamaları koruyacak şekilde filtrelendi.Uzunluğu normalize edilmiş gen bolluğu, ilk önce en iyi benzersiz hizalamadan gelen eklerin sayılmasıyla ve daha sonra bulanık haritalı ekler için, benzersiz eklerin sayısıyla orantılı olarak karşılık gelen hedef genlere kesirli sayımların eklenmesiyle hesaplandı.
Genişletilmiş OMD'den gelen genomlar ("Ca. Eudormicrobiaceae"den ek MAG'lerle birlikte, aşağıya bakın), genişletilmiş bir mOTU referans veritabanı oluşturmak için mOTUs74 metagenomik analiz aracı veritabanına (v.2.5.1) eklendi.On uscMG'den yalnızca altı tek kopya genom (23.528 genom) hayatta kaldı.Veritabanının genişletilmesi, tür düzeyinde 4.494 ek kümeyle sonuçlandı.1038 metagenom, varsayılan mOTU parametreleri (v.2) kullanılarak analiz edildi.644 mOTU kümesinde bulunan toplam 989 genom (%95 REF, %5 SAG ve %99,9'u MarDB'ye ait) mOTU profili tarafından tespit edilemedi.Bu, MarDB genomlarının çeşitli ek deniz izolasyonu kaynaklarını yansıtmaktadır (tespit edilemeyen genomların çoğu, çökeltilerden, deniz konakçılarından vb. izole edilen organizmalarla ilişkilidir).Bu çalışmada açık okyanus ortamına odaklanmaya devam etmek için, tespit edilmedikçe veya bu çalışmada oluşturulan genişletilmiş mOTU veritabanına dahil edilmedikçe bunları aşağı akış analizinin dışında bıraktık.
OMD'deki MAG, SAG ve REF'den gelen tüm BGC'ler (yukarı bakın), tüm metagenomik iskelelerde tanımlanan BGC'lerle birleştirildi (antiSMASH v.5.0, varsayılan parametreler) ve BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM alanı )75 kullanılarak karakterize edildi.Bu özelliklere dayanarak, BGC'ler arasındaki tüm kosinüs mesafelerini hesapladık ve bunları sırasıyla 0,2 ve 0,8'lik mesafe eşiklerini kullanarak GCF ve GCC olarak gruplandırdık (ortalama bağlantılar).Bu eşikler, daha önce Öklid mesafesi75 ile birlikte kosinüs mesafesi kullanılarak kullanılan eşiklerin bir uyarlamasıdır; bu, orijinal BiG-SLICE kümeleme stratejisindeki (Ek Bilgiler) bazı hataları hafifletir.
Daha sonra BGC'ler, daha önce açıklandığı gibi parçalanma riskini azaltmak ve 1038 metagenomlarda bulunmayan MarDB REF'leri ve SAG'leri hariç tutmak için yapı iskelelerinde kodlanan yalnızca ≥5 kb'yi tutacak şekilde filtrelendi (yukarıya bakın).Bu, OMD genomu tarafından toplam 39.055 BGC'nin kodlanmasıyla sonuçlandı ve ilave 14.106'sı metagenomik parçalar üzerinde tanımlandı (yani MAG'ler halinde birleştirilmemiş).Bu "metagenomik" BGC'ler, veri tabanında yakalanmayan deniz mikrobiyomu biyosentez potansiyelinin oranını tahmin etmek için kullanıldı (Ek Bilgiler).Her BGC, anti-SMASH veya BiG-SCAPE76'da tanımlanan daha kaba ürün kategorileri tarafından tanımlanan öngörücü ürün türlerine göre işlevsel olarak karakterize edildi.Nicelemede örnekleme yanlılığını önlemek için (GCC/GCF'nin taksonomik ve fonksiyonel bileşimi, GCF ve GCC'nin referans veritabanlarına mesafesi ve GCF'nin metagenomik bolluğu), her tür için GCF başına yalnızca en uzun BGC'yi tutarak 39.055 BGC daha da tekilleştirildi, toplamda 17.689 BGC elde edildi.
GCC ve GCF'nin yeniliği, hesaplanan veri tabanı (BiG-FAM'deki RefSeq veri tabanı)29 ile deneysel olarak doğrulanan (MIBIG 2.0)30 BGC arasındaki mesafeye dayalı olarak değerlendirildi.17.689 temsili BGC'nin her biri için ilgili veri tabanına en küçük kosinüs mesafesini seçtik.Daha sonra bu minimum mesafelerin, duruma göre GCF veya GCC'ye göre ortalaması alınır (ortalama).Veritabanına olan mesafe 0,2'den büyükse bir GCF yeni olarak kabul edilir; bu, (ortalama) GCF ile referans arasındaki ideal ayrıma karşılık gelir.GCC için, bağlantılarla uzun vadeli bir ilişkiyi kilitlemek amacıyla GCF tarafından tanımlanan eşiğin iki katı olan 0,4'ü seçiyoruz.
BGC'nin metagenomik bolluğu, gen seviyesi profillerinden elde edilebilen biyosentetik genlerinin (anti-SMASH tarafından belirlendiği üzere) ortalama bolluğu olarak tahmin edildi.Daha sonra her bir GCF veya GCC'nin metagenomik bolluğu, temsili BGC'lerin (17.689 üzerinden) toplamı olarak hesaplandı.Bu bolluk haritaları daha sonra, sıralama çabalarını da hesaba katan numune başına mOTU sayısı kullanılarak hücresel kompozisyon için normalleştirildi (genişletilmiş veriler, Şekil 1d).GCF veya GCC'nin yaygınlığı, bolluğu > 0 olan numunelerin yüzdesi olarak hesaplandı.
Numuneler arasındaki Öklid mesafesi normalleştirilmiş GCF profilinden hesaplandı.Bu mesafelerin boyutu UMAP77 kullanılarak küçültüldü ve elde edilen yerleştirmeler, HDBSCAN78 kullanılarak denetimsiz yoğunluk bazlı kümeleme için kullanıldı.HDBSCAN tarafından kullanılan bir küme için optimum minimum nokta sayısı (ve dolayısıyla küme sayısı), küme üyeliğinin kümülatif olasılığının maksimuma çıkarılmasıyla belirlenir.Tanımlanan kümeler (ve permütasyonlu çok değişkenli varyans analizindeki (PERMANOVA) önyargıyı hesaba katmak için bu kümelerin rastgele dengeli bir alt örneği), PERMANOVA kullanılarak azaltılmamış Öklid mesafelerine karşı anlamlılık açısından test edildi.Örneklerin ortalama genom boyutu, mOTU'nun göreceli bolluğuna ve genom üyelerinin tahmini genom boyutuna göre hesaplandı.Özellikle, her bir mOTU'nun ortalama genom boyutu, üyelerinin genom boyutlarının tamlık için düzeltilmiş (filtrelemeden sonra) ortalaması olarak tahmin edilmiştir (örneğin, 3 Mb uzunluğa sahip %75'i tamamlanmış bir genomun ayarlanmış boyutu 4'tür). Mb).bütünlüğü ≥%70 olan orta genomlar için.Daha sonra her numune için ortalama genom boyutu, göreceli bolluğa göre ağırlıklandırılan mOTU genom boyutlarının toplamı olarak hesaplandı.
OMD'deki genom kodlu BGC'lerin filtrelenmiş bir seti, bakteriyel ve arkeal GTDB ağaçlarında (≥5 kb çerçevelerde, 1038 metagenomda bulunmayan REF ve SAG MarDB hariç, yukarıya bakın) ve filogenetik temele dayalı olarak tahmin edilen ürün kategorilerinde gösterilir. genomun konumu (yukarıya bakın).İlk olarak, türdeki en fazla BGC'ye sahip genomu temsili olarak kullanarak verileri türlere göre azalttık.Görselleştirme için temsilciler ayrıca ağaç gruplarına bölündü ve yine her hücre sınıfı için en fazla sayıda BGC içeren genom temsilci olarak seçildi.BGC ile zenginleştirilmiş türler (>15 BGC'ye sahip en az bir genom), bu BGC'lerde kodlanan ürün türleri için Shannon Çeşitlilik Endeksi hesaplanarak daha fazla analiz edildi.Tahmin edilen tüm ürün tipleri aynıysa, kimyasal hibritlerin ve diğer karmaşık BGC'lerin (anti-SMAH tarafından tahmin edildiği gibi), kümedeki sıralarına bakılmaksızın (örneğin, protein-bakteriyosin ve bakteriyosin-proteoprotein füzyonu) aynı ürün tipine ait olduğu kabul edilir. vücut).hibrit).
Malaspina numunesi MP1648'den kalan DNA (6 ng olduğu tahmin edilmektedir), SAMN05421555 biyolojik numunesine karşılık gelir ve kısa okuma için Illumina SRR3962772 metagenomik okuma seti ile eşleşir, PacBio kiti SMRTbell gDNA numune amplifikasyonunu kullanmak için ultra düşük girişli PacBio sekanslama protokolüne göre işlenir kiti (100-980-000) ve SMRTbell Express 2.0 şablon hazırlama kiti (100-938-900).Kısaca, geri kalan DNA Covaris (g-TUBE, 52104) kullanılarak kesildi, onarıldı ve saflaştırıldı (ProNex boncukları).Saflaştırılmış DNA daha sonra kütüphane hazırlama, amplifikasyon, saflaştırma (ProNex boncukları) ve boyut seçimine (>6 kb, Blue Pippin) tabi tutulur ve ardından son saflaştırma adımından (ProNex boncukları) ve Sequel II platformunda sekanslama yapılır.
İlk ikisinin yeniden inşası ca.MAG Eremiobacterota için, başlangıçta kontaminasyon puanlarına göre filtrelenen (daha sonra gen kopyaları olarak tanımlandı, aşağıya bakın) >%99'dan fazla altı ek ANI belirledik (bunlar Şekil 3'te yer almaktadır).Ayrıca üzerinde “Ca” yazan bir tepsi de bulduk.Eremiobacterota'yı çeşitli çalışmalardan23 aldı ve bunları çalışmamızdaki sekiz MAG ile birlikte, alt örnekleme için BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – bir bayrak) kullanan 633 ökaryotik zenginleştirilmiş (>0,8 µm) numuneden metagenomik okumalar için referans olarak kullandı. haritalama (5 milyon okuma).Zenginleştirmeye özgü haritalara dayanarak (%95 hizalama kimliği ve %80 okuma kapsamı ile filtrelenmiş), montaj için 10 metagenom (beklenen kapsam ≥5x) ve içerik korelasyonu için ilave 49 metagenom (beklenen kapsam ≥1x) seçildi.Yukarıdakiyle aynı parametreler kullanılarak bu numuneler bindirildi ve 10 ilave 'Ca' eklendi.MAG Eremiobacterota restore edildi.Bu 16 MAG (zaten veri tabanında bulunan iki tanesini saymazsak), genişletilmiş OMD'deki toplam genom sayısını 34.815'e getiriyor.MAG'lere genomik benzerliklerine ve GTDB'deki konumlarına göre taksonomik sıralar atanır.18 MAG, aynı aile içindeki 5 türe (intraspesifik ANI >%99) ve 3 cinse (intrajenerik ANI %85 ila %94) dRep kullanılarak çoğaltılmıştır79.Tür temsilcileri bütünlük, kontaminasyon ve N50'ye göre manuel olarak seçildi.Önerilen terminoloji Ek Bilgilerde verilmiştir.
'Ca'nın bütünlüğünü ve kirlenmesini değerlendirin.MAG Eremiobacterota'da, CheckM ve Anvi'o tarafından kullanılan soy ve alana özgü tek kopya işaretleyici gen setlerinin yanı sıra uscMG'nin varlığını değerlendirdik.40 uscMG'den 2 kopyanın tanımlanması, herhangi bir potansiyel kontaminasyonu ortadan kaldırmak için filogenetik yeniden yapılanma (aşağıya bakın) ile doğrulandı (bu, bu 40 işaretleyici gen temelinde %5'e karşılık gelir).Beş temsili MAG'nin ek bir çalışması 'Ca.Bu yeniden yapılandırılmış genomlardaki düşük kirletici madde seviyesi, bolluk ve dizi kompozisyonu korelasyonlarına (Ek Bilgiler)59 dayanan etkileşimli Anvi'o arayüzü kullanılarak Eremiobacterota türleri için doğrulandı.
Filogenomik analiz için beş temsili MAG "Ca" seçtik.Eudormicrobiaceae”, tüm türler “Ca.Eremiobacterota genomu ve diğer filumların üyeleri (UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria ve Planctomycetota dahil) GTDB'den (r89)13 temin edilebilir.Bu genomların tümü, daha önce tek kopya işaretleyici gen ekstraksiyonu ve BGC açıklaması için tarif edildiği gibi açıklandı.GTDB genomları yukarıdaki bütünlük ve kontaminasyon kriterlerine göre korunmuştur.Filogenetik analiz, Anvi'o Phylogenetics59 iş akışı kullanılarak yapıldı.Ağaç, Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 tarafından tanımlanan 39 tandem ribozomal proteinin hizalanması üzerinde IQTREE (v.2.0.3) (varsayılan seçenekler ve -bb 1000)80 kullanılarak oluşturulmuştur.Pozisyonları azaltıldı.genomun en az %50'sini kapsayacak şekilde82 ve Planctomycecota, GTDB ağaç topolojisine dayalı olarak dış grup olarak kullanıldı.Aynı araçlar ve parametreler kullanılarak 40 uscMG'den oluşan bir ağaç oluşturuldu.
Ortak mikrobiyal özellikleri tahmin etmek için Traitar'ı (v.1.1.2) varsayılan parametrelerle (nükleotidlerden gelen fenotip)83 kullandık.Genomdaki protein kodlayan genin içeriğine bağlı olan, önceden geliştirilmiş bir yırtıcı endekse84 dayalı potansiyel bir yırtıcı yaşam tarzını araştırdık.Spesifik olarak, –more-sensive –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 seçeneklerini kullanarak genomdaki proteinleri OrthoMCL veritabanı (v.4)85 ile karşılaştırmak için DIAMOND kullanıyoruz VE karşılık gelen genleri sayıyoruz. Yırtıcı hayvanlar ve yırtıcı olmayanlar için işaretleyici genler.Endeks, yırtıcı ve yırtıcı olmayan işaretlerin sayısı arasındaki farktır.Ek bir kontrol olarak “Ca” genomunu da analiz ettik.Entotheonella TSY118 faktörü Ca ile ilişkisine dayanmaktadır.Eudoremicrobium (büyük genom boyutu ve biyosentetik potansiyel).Daha sonra yırtıcı ve yırtıcı olmayan işaretleyici genler ile Ca'nın biyosentetik potansiyeli arasındaki potansiyel bağlantıları test ettik.Eudormicrobiaceae” ve birden fazla genin (herhangi bir işaretleyici gen türünden, yani yırtıcı/yırtıcı olmayan genden) BGC ile örtüşmediğini buldu, bu da BGC'nin yırtıcılık sinyallerini karıştırmadığını öne sürdü.Salgı sistemini, pili ve flagella'yı spesifik olarak incelemek için TXSSCAN (v.1.0.2) kullanılarak karıştırılmış replikonlara ek genomik açıklama yapıldı86.
Beş temsili 'Ca', Tara okyanuslarının prokaryotik ve ökaryotik zenginleştirme fraksiyonlarından 623 metatranskriptomun haritalanmasıyla haritalandı22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a bayrağı kullanılarak).Eudormicrobiaceae genomu.BAM dosyaları, %80 okuma kapsama alanı ve %95 kimlik filtrelemeden sonra FeatureCounts (v.2.0.1)88 ile işlendi ( featureCounts –birincil -O –fraksiyon -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p seçenekleriyle) gen başına ekleme sayısı.Oluşturulan haritalar, gen uzunluğu ve işaretleyici gen bolluğu mOTU (yerleştirme sayısı >0 olan genler için uzunluk normalize edilmiş ortalama ekleme sayısı) için normalleştirildi ve her gen seviyesinin hücre başına göreceli ifadesini elde etmek için log-22.74'e dönüştürüldü; bu aynı zamanda sıralama sırasında numuneden numuneye değişkenlik.Bu tür oranlar, karşılaştırmalı analize izin vererek göreceli bolluk verileri kullanıldığında kompozisyon sorunlarını azaltır.Genomun yeterince büyük bir kısmının tespit edilmesine olanak sağlamak amacıyla ileri analiz için yalnızca 10 mOTU işaretleyici genden >5'ine sahip numuneler dikkate alındı.
'Ca'nın normalleştirilmiş transkriptom profili.E. taraoceanii, UMAP kullanılarak boyut azaltımına tabi tutuldu ve ortaya çıkan temsil, ifade durumunu belirlemek için HDBSCAN (yukarı bakın) kullanılarak denetimsiz kümeleme için kullanıldı.PERMANOVA, orijinal (azaltılmamış) mesafe uzayında tanımlanan kümeler arasındaki farkların önemini test eder.Bu koşullar arasındaki farklı ekspresyon, genom boyunca test edildi (yukarıya bakın) ve 6 fonksiyonel grupta 201 KEGG yolu tanımlandı: BGC, TXSSCAN'dan gelen salgı sistemi ve flagellar genler, bozunma enzimleri (proteaz ve peptidazlar) ve yırtıcı ve yırtıcı olmayan. yırtıcı genler.yırtıcı indeks belirteçleri.Her örnek için, her sınıfa yönelik medyan normalleştirilmiş ifadeyi hesapladık (BGC ifadesinin kendisinin, söz konusu BGC için biyosentetik genlerin medyan ifadesi olarak hesaplandığına dikkat edin) ve eyaletler arası anlamlılık açısından test ettik (FDR için ayarlanmış Kruskal-Wallis testi).
Sentetik genler GenScript'ten ve PCR primerleri Microsynth'ten satın alındı.DNA amplifikasyonu için Thermo Fisher Scientific'ten Phusion polimeraz kullanıldı.DNA saflaştırması için NucleoSpin plazmidleri, NucleoSpin jeli ve Macherey-Nagel'den PCR saflaştırma kiti kullanıldı.Kısıtlama enzimleri ve T4 DNA ligazı New England Biolabs'tan satın alındı.İzopropil-p-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) (Biosynth) ve 1,4-ditiyotreitol (DTT, AppliChem) dışındaki kimyasallar Sigma-Aldrich'ten satın alındı ​​ve daha fazla saflaştırılmadan kullanıldı.Antibiyotikler kloramfenikol (Cm), spektinomisin dihidroklorür (Sm), ampisilin (Amp), gentamisin (Gt) ve karbenisilin (Cbn), AppliChem'den satın alındı.Bacto Triptone ve Bacto Yeast Extract ortam bileşenleri BD Biosciences'tan satın alınmıştır.Sıralama için trypsin Promega'dan satın alındı.
Gen dizileri, SMASH karşıtı tahmin edilen BGC 75.1'den ekstre edildi.E. malaspinii (Ek bilgi).
embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) ve embAM (genler arası bölgeler dahil) genleri, E'de ekspresyon için optimize edilmiş kodonlarla ve kodonlar olmadan pUC57'de (AmpR) sentetik yapılar olarak dizildi. Ne zaman.EmbA geni, BamHI ve HindIII bölünme bölgeleri ile pACYCDuet-1(CmR) ve pCDFDuet-1(SmR)'nin ilk çoklu klonlama bölgesine (MCS1) alt klonlandı.embM ve embMopt genleri (kodon optimizasyonlu), BamHI ve HindIII ile MCS1 pCDFDuet-1(SmR)'ye alt klonlandı ve pCDFDuet-1(SmR) ve pRSFDuet-1(KanR) (MCS2)'nin ikinci çoklu klonlama bölgesine yerleştirildi. Ndel/ChoI.EmbAM kaseti, BamHI ve HindIII bölünme bölgeleriyle pCDFDuet1(SmR)'ye alt klonlandı.Orf3/embI geni (lokus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3), EmbI_OE_F_NdeI ve EmbI_OE_R_XhoI primerleri kullanılarak örtüşme uzatma PCR'si ile oluşturuldu, NdeI/XhoI ile sindirildi ve aynı kısıtlama enzimleri kullanılarak pCDFDuet-1-EmbM'ye (MCS1) bağlandı (Ek). masa).6).Kısıtlama enzimi sindirimi ve ligasyonu, üreticinin protokolüne (New England Biolabs) göre gerçekleştirildi.