310 10*1mm Paslanmaz çelik sarmal boru kimyasal bileşeni, Spidroinin N-terminal alanları, amiloid fibrillere dayanan hidrojeller oluşturur ve protein immobilizasyonu için bir platform sağlar.

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Sınırlı CSS desteğine sahip bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Ayrıca sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Slayt başına üç makale gösteren kaydırıcılar.Slaytlar arasında ilerlemek için geri ve ileri düğmelerini veya her slaytta ilerlemek için sondaki slayt denetleyici düğmelerini kullanın.

Şartname

310 10*1mm Paslanmaz çelik sarmal boru tedarikçileri

Kimyasal bileşim

Mekanik özellikler

Rekombinant örümcek ipeği proteinleri (örümcek ipeği proteinleri), yeni biyomateryallerin geliştirilmesinde birçok potansiyel uygulamaya sahiptir, ancak bunların multimodal ve topaklaşmaya eğilimli doğası, bunların elde edilmesini zorlaştırıyor ve kullanımını kolaylaştırıyor.Burada rekombinant minyatür spidroin proteinlerinin ve daha da önemlisi N-terminal alanının (NT) kendisinin 37 °C'de hızla kendi kendini destekleyen ve şeffaf hidrojeller oluşturduğunu rapor ediyoruz.NT ve yeşil floresan protein veya purin nükleosid fosforilazdan oluşan füzyon proteinleri, tamamen işlevsel füzyon proteinleri oluşturur.Hidrojeller.Sonuçlarımız, rekombinant NT ve füzyon proteinlerinin yüksek ekspresyon verimi sağladığını ve hidrojellere şeffaflık, çapraz bağlanma olmadan jelleşme ve aktif proteinlerin yüksek yoğunlukta doğrudan immobilizasyonu gibi çekici özellikler kazandırdığını göstermektedir.
Örümceklerin her biri belirli bir tür ipek üreten yedi farklı ipek bezi seti vardır.Yedi ipek türünün tümü, yaklaşık 6000 kalıntı uzunluğunda örümcek ipeği proteinlerinden (spidroinler) oluşur ve küresel N- ve C-terminal alanlarıyla (NT ve CT)1,2 çevrelenen geniş bir merkezi tekrar bölgesi içerir.En çok incelenen ipek türü olan birincil ampulla, birincil ampulla bezi tarafından üretilir.Bu bezde, epitelyal hücrelerin tek katmanı, spidroin proteinlerini sentezler ve bunları bezin lümenine salgılar; burada bunlar son derece yüksek konsantrasyonlarda (%30-50 a/h) çözünür bir formda (doping) bulunur3,4.Bezdeki ana ampullar spidroin proteinlerinin organizasyonu ve yapısı tartışılmıştır, ancak deneysel kanıtların çoğu genel olarak sarmal ve/veya rastgele sarmal yapıların ve misel veya katmanlı yapıların varlığını göstermektedir5,6,7,8,9,10.Tekrarlanan alanlar, β-tabaka nanokristalleri ve amorf yapılar11,12,13,14,15 oluşturarak ipek liflerinin mekanik özelliklerini düzenlerken, uç alanlar, ipek bezi16,17,18 boyunca değişen koşullara yanıt olarak ipek liflerini düzenler.İpek oluşumunu kontrol ederek 19. Terminal alanları evrimsel olarak korunur ve işlevleri tüm spidroin proteinleri için ortak olabilir 2,20,21.Bezden geçiş sırasında, spidroinin pH'ı yaklaşık 7,6'dan < 5,716'ya düşer ve giderek daralan kanal boyunca hareketin aracılık ettiği kayma ve gerilme ile artar.Çözümde, CT bir α-helisel kurucu paralel dimerdir17, ancak düşük pH ve kesme kuvvetlerine yanıt olarak CT, β-katmanlarını16, 17 açar ve değiştirir, muhtemelen Convert 16'nın tekrarlayan bölgelerinde β-katmanlarını tetikler. NT, monomeriktir. Bezin lümenindeki koşulları yansıtan koşullar ve spidroinin çözünürlüğüne aracılık eder, ancak düşük pH'ta, bir dizi karboksilik asit yan zincirinin protonasyonu, NT'nin yaklaşık 6.5'lik bir pKa ile dimerizasyonuna yol açar, böylece NT'yi stabilize eder ve spidroini büyük miktarlarda sabitler. miktarları.ağlar16,18.Dolayısıyla NT, kaplamadaki bir monomerden fiberdeki bir dimere dönüşerek filaman oluşumunda önemli bir rol oynar23,24,25.NT, bugüne kadar çalışılan tüm koşullar altında yüksek oranda çözünür ve sarmal kalır16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, bu da onun heterolog proteinlerin üretimi için çözünürlüğü arttırıcı bir etiket olarak geliştirilmesine ilham kaynağı olmuştur.
Saflaştırma için bir NT, bir kısa tekrar bölgesi, bir CT ve bir His6 etiketinden (His-NT2RepCT) oluşan rekombinant mini örümcek ipeği proteini, sulu tamponda doğal örümcek ipeği proteini kadar çözünür ve ipek örümceğinin doğal önemli özelliklerini taklit eder. .kapsam 25.31.His-NT2RepCT, pH 8 çözünür kaplamanın pH 525,32,33,34,35 su banyosuna ekstrüzyona tabi tutulduğu bir biyomimetik makine kullanılarak sürekli fiberler halinde eğrilebilmektedir.His-NT2RepCT'yi eksprese eden E. coli'nin biyoreaktör fermantasyonu ve bunu takip eden tedavi sonrası, saflaştırma sonrasında >14 g/L verimle sonuçlandı.His-NT2RepCT'nin yüksek verimi, yüksek çözünürlüğü ve asidik koşullara yeterli yanıtının tümü NT23, 25, 34'e atfedilir.
Burada, bir protein çözeltisini 37 °C'de inkübe ederek, tek başına NT de dahil olmak üzere rekombinant spidroin proteinlerinden şeffaf hidrojellerin hızlı oluşumunu rapor ediyoruz.Tioflavin T floresansı (ThT), Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FTIR), nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak NT ve mikroörümcek proteinlerinin β-tabakalara ve amiloid benzeri fibrillere yapısal dönüşüm geçirdiğini bulduk. jeller oluştuğunda.Ek olarak NT ve yeşil floresan protein (GFP) veya purin nükleosid fosforilazın (PNP) füzyon proteinleri, tamamen işlevsel füzyon fragmanlarına sahip hidrojeller oluşturur.Heterolog konakçılarda yüksek verimli ekspresyon, fizyolojik koşullar altında hızlı hidrojel oluşumuyla birleştiğinde, mühendislik fonksiyonlarına sahip uygun maliyetli hidrojel üretimi olasılığını açar.
Bildirilen çoğu rekombinant spidroin proteininin36 aksine, His-NT2RepCT, pH 8'de Tris-HCl tamponunda stabildir ve çökelmeden 500 mg/mL'ye kadar konsantre edilebilir25.Bu nedenle, bu proteinin 37°C'de inkübe edildiğinde hızla optik olarak berrak, kendi kendini destekleyen hidrojeller oluşturduğunu bulduğumuzda şaşırdık (Şekil 1b-d).Daha ileri çalışmalar, His-NT2RepCT jelasyonunun geniş bir protein konsantrasyonu aralığında (10-300 mg/mL) meydana geldiğini ve bu konsantrasyonun jelleşme süresiyle ters orantılı olduğunu gösterdi (Şekil 1c ve Ek Şekil 1).His-NT2RepCT'nin hangi bölümlerinin hidrojel oluşumuna aracılık ettiğini bulmak için daha sonra her alanı ayrı ayrı ve çeşitli kombinasyonlarda bir şişe ters çevirme tahlili kullanarak inceledik (Şekil 1a,b).Rekombinant spidroinin test edilen tüm fraksiyonları, çökeltilmiş 2Rep hariç (Şekil 1b) 1 saatten daha kısa sürede jeller (300 mg/mL protein konsantrasyonunda) oluşturdu.Bu, NT ve CT'nin tek başına, kombinasyon halinde veya tekrarlarla ilişkili olarak 37°C'de jelleşebildiğini ve His6 etiketinin bu süreci önemli ölçüde etkilemediğini göstermektedir.NT'nin oldukça çözünür ve stabil bir protein olduğu ve rekombinant spidroin hidrojelleriyle ilgili önceki raporların jelleşme etkilerini tekrar bölgelerindeki ve/veya CT'lerdeki konformasyonel değişikliklere bağladığı yönündeki ortak fikir göz önüne alındığında, NT'nin kendisi bunu yapabilir.Jelleşmenin keşfi beklenmedik bir durumdu.Ek Tablo 1) 37, 38, 39. Dikkat çekici bir şekilde, NT zaten ≥ 300 mg/mL konsantrasyonda 10 dakika içinde jelleşti (Şekil 1c).Çeşitli NT konsantrasyonları ile şişe ters çevirme deneyleri, >50 mg/mL'de NT çözeltisinin, karşılık gelen konsantrasyonda His-NT2RepCT'den daha hızlı jelleştiğini gösterdi (a/h, Şekil 1c).
Bu çalışmada incelenen çeşitli spidroin yapılarının şematik gösterimi.b Çeşitli rekombinant spidroin proteinleri (300 mg/mL) için 37 °C'de jelleşme süresi, flakon ters çevrilerek doğrulandı.İnkübasyon olmadan hemen CT jeli (<300 mg/mL), 2Rep çökelir (300 mg/mL, 5 mm ölçek).c 37°C'de belirtilen protein konsantrasyonlarında His-NT2RepCT ve NT'nin jelleşme süresi.d His-NT2RepCT ve NT hidrojellerinin, altında sırasıyla örümcek ve “NT” harfinin yazılı olduğu fotoğrafları (her ikisi de 200 mg/mL, ölçek çubuğu 5 mm).
Çeşitli rekombinant spidroin proteinleri tarafından oluşturulan hidrojeller biraz farklı renklere sahiptir ve çıplak göz gözlemi, değişen derecelerde şeffaflık gösterir (Şekil 1b).NT jelleri son derece berrakken diğer jeller opak hale gelir.Silindirik tüplere dökülen His-NT2RepCT ve NT jelleri kalıptan bozulmadan çıkarılabilir (Şekil 1d).
Doğal örümcek ipeği kaplamalarının, artık rekombinant spidroin proteinlerinin jelleşmesine neden olduğu bulunan koşullar altında jelleşip jelleşmediğini test etmek için, İsveç köprü örümceğinin (Larinioides sclopetarius) büyük ampulla bezinden kaplamalar toplandı.Kaplamalar, 50 mg/mL'de (ölçülen kuru ağırlığa göre) 20 mM Tris-HCl tamponunda saklandı, ancak 37 °C'de 21 günlük inkübasyon sırasında herhangi bir jelleşme gözlenmedi (Ek Şekil 2a).
Bu jelleri ölçmek için, jelleşme sürecini incelemek ve genel mekanik özellikleri belirlemek amacıyla reolojik ölçümler kullanılabilir.Özellikle, yüksek sıcaklıklarda depolama modülünün (esneklik) izlenmesi, kaplamanın viskoelastik özelliklerinin yanı sıra jelleşme sıcaklığı hakkında da bilgi sağlayabilir.Sıcaklık artışı deneyleri (25-45°C'de 1°C/dakika kullanılarak, doğal ipek stok çözeltilerinin kullanıldığı önceki çalışmalara dayanarak)40,41 His-NT2RepCT ve NT çözümlerinin depolama modüllerinin artan sıcaklıkla arttığını gösterdi.arttırıldı (Şekil 2 ve Ek Şekil 3).Özellikle NT modülü, His-NT2RepCT'ye kıyasla daha düşük bir sıcaklıkta büyümeye başladı; bu, NT'nin doğrudan His-NT2RepCT ile 37°C'de inkübe edildiği zaman gözlemlenen daha hızlı jel süresiyle tutarlıdır (Şekil 1).Sıcaklıkta bir sonraki düşüşten sonra, depolama modülü daha düşük değerlere dönmedi ve kayıp modülünün üzerinde kaldı (bkz. Ek Şekil 3), bu da termal olarak geri dönüşü olmayan stabil jelleşmeyi gösterir.Jelleşmeden sonra, 100–500 mg/mL konsantrasyonda His-NT2RepCT hidrojelleri için son elastik modül 15 ila 330 kPa arasında değişmiştir ve NT hidrojelleri (100–500 mg/mL) için son elastik modül 2 ila 1400 arasında değişmiştir. kPa (Şekil 2 ve tüm rampa verileri) bkz. Ek Şekil 3).
a His-NT2RepCT (300 mg/mL) ve b NT (300 mg/mL) ölçümleri sırasında çalkalamayla sıcaklıktaki değişiklik.Oklar sıcaklık eğilimini gösterir ve depolama modülü verilerinin daha açık gölgelenmesi, cihaz için üretici tarafından belirtilenden daha düşük tork değerlerinde yapılan testleri gösterir; bu da artan gürültünün nedenidir.c Yüksek sıcaklıktan (100, 300 ve 500 mg/mL) sonra His-NT2RepCT ve NT'nin son modül birikimi.Tüm modül okumaları 0,1 Hz frekansta alınır.
Jelleşmeyle ilişkili konformasyonel değişiklikleri araştırmaya yönelik potansiyel bir yöntem olarak, His-NT2RepCT ve NT'nin FTIR spektrumlarını 37°C'de jelleşmeden önce ve sonra kaydettik (Şekil 3a,b).Beklendiği gibi, His-NT2RepCT ve NT çözeltilerinin spektrumları, 1645 cm-1'de belirgin bir bant ile a-sarmal/rastgele bobin ikincil yapısını gösteren proteinlere karşılık geldi.Her iki hidrojel için jelleşme, orta I bandında yaklaşık 1617 cm-1 ve 1695 cm-1'de iki kolun oluşmasıyla sonuçlandı (Şekil 3a, b), bu da antiparalel β-tabaka yapılarının oluşumunu gösterir.Bu değişiklikler ayrıca ilgili ikinci türev ve fark jelasyon spektrumlarında da açıkça görülebilir (Ek Şekil 4b).NT β katmanının iki bandı, His-NT2RepCT'ninkinden daha belirgindi; bu, NT hidrojelindeki β katmanı bantlarının toplam içeriğinin NT2RepCT hidrojelininkinden daha yüksek olduğunu gösterir.
37°C'de inkübasyondan önce (çözelti) ve sonra (jel) His-NT2RepCT ve b NT'nin (her ikisi de 500 mg/mL) FTIR absorpsiyon spektrumları.c Yeniden süspanse edilmiş 50 mg/ml NT2RepCT jellerinin ve d NT'nin TEM görüntüleri.Ölçek çubuğu 200 nm.e His-NT2RepCT ve NT hidrojellerinin fiber çapları.n = 100 ölçülen fibril, p < 0,0001.Hata çubukları standart sapmayı gösterir.Hata çubuklarının merkezi ortalamadır.İstatistiksel analiz için eşleştirilmemiş bir t testi (iki kuyruklu) kullanıldı.f Çeşitli rekombinant spidroin proteinlerinin (100 mg/mL) 37 °C'de çalkalanmadan ThT floresansı.%0, %5, %10 ve %20 tohumlarla 100 mg/mL NT jelden g NT (100 mg/mL) aşılama deneyleri.
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak jelin analizi, hidrojelin amiloid benzeri fibrillerden oluştuğunu gösterdi (Şekil 3c, 3d).NT şeklindeki fibriller uzatılmış (5-12 nm çapında) ve dallanmamışken, His-NT2RepCT fibrillerinin uzunluğu daha kısa ve çapı önemli ölçüde daha genişti (7-16 nm) (Şekil 3e).Bu sonuçlar tiyoflavin T (ThT) tahlilini kullanarak fibrozisin kinetiğini takip etmemizi sağladı.Tüm rekombinant spidroin proteinleri için, numuneler 37 ° C'de inkübe edildiğinde floresan sinyali arttı (Şekil 3f, Ek Şekil 5a).Bu bulguyla tutarlı olarak, NT ve His-NT2RepCT'nin jelleşme koşulları altında mikroskobik incelenmesi, ThT pozitif agregatların gözle görülür lokal birikimi olmadan ThT floresansında düzgün bir artış ortaya çıkardı (Ek Şekil 5b,c).ThT-pozitif fibrillerin oluşumuna, NT ve His-NTCT bulanıklığında bir artış eşlik etmedi (Ek Şekil 5d), bu, jeldeki bir fibril ağının, jel berraklığından ödün vermeden oluşabileceği anlamına gelir.Küçük miktarlarda önceden oluşturulmuş fibriller ekleyerek tohumlama, bazı amiloidlerin42,43,44 fibril oluşumunu önemli ölçüde hızlandırabilir, ancak NT hidrokoagülan çözeltisine %5, %10 veya %20 (a/a) NT eklenebilir.tohumlama etkisi (Şekil 3g).Belki de bunun nedeni hidrojeldeki fibrillerin nispeten sabit olması ve tohum olarak kullanılamamasıdır.
Rekombinant spidroin proteinlerinin yüksek sıcaklıklarda beklenmedik davranışı, jel oluşumuyla ilişkili konformasyonel değişiklikleri tanımlamak için daha fazla nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi çalışmasına yol açtı.Zaman içinde 37°C'de kaydedilen His-NT2RepCT çözümlerinin NMR spektrumları, CT'nin hala kısmen katlanmış olduğunu gösterirken, NT ve 2Rep sinyallerinin kaybolduğunu gösterdi (Şekil 4a), bu da His-NT ve 2Rep'in kısmen kontrol edilen oluşumunun esas olarak NT ve 2Rep olduğunu düşündürmektedir. NT2RepCT hidrojel.CT sinyali aynı zamanda orijinal yoğunluğunun %20'sine kadar zayıflatılmıştır; bu da CT'nin çoğunlukla sabitlendiğini ve hidrojel yapısına dahil edildiğini gösterir.Önceden inkübe edilmiş numunedeki kadar hareketli olan ve dolayısıyla çözelti NMR'si ile gözlemlenen CT'nin daha küçük bir kısmı için, muhtemelen His-NT2Rep'in bağlı kısmının zor immobilizasyonundan dolayı spektrumlarda ilk 10 yapılandırılmış kalıntıya yönelik sinyaller eksiktir.Hidrojellerin durumu -NT2RepCT'nin NMR spektrumları, a-helislerin ve β-katmanlarının baskın varlığını ve daha az ölçüde rastgele bobin konformasyonunu ortaya çıkardı (Şekil 4b).Yalnızca NT'de bulunan metiyonin kalıntılarının kimyasal kayma analizi, bu alanın bir p-tabaka yapısına dönüştürüldüğünü gösterdi.Çözeltideki NT'nin zamana bağlı spektrumu, sinyal yoğunluğunda düzgün bir azalma gösterdi (Şekil 4c) ve NT hidrojellerinin katı hal NMR'si, NT kalıntılarının çoğunun β-tabaka yapılarına dönüştürüldüğünü gösterdi (Şekil 4d).2Rep'in yapısı, toplanma eğilimi nedeniyle ayrı olarak belirlenemedi.Bununla birlikte, NTCT ve His-NT2RepCT hidrojellerinin katı hal NMR spektrumları çok benzer görünüyordu (Şekil 4b; Ek Şekil 6b), bu da 2Rep'in His-NT2RepCT hidrojelinin yapısal kısmına çok az katkıda bulunduğunu ortaya koydu.CT hidrojelleri için a-helisler, β-tabakalar ve rastgele sarmal ikincil yapıların mevcut olduğu bulundu (Ek Şekil 6d).Bu, CT'nin bazı kısımlarının α-helis olarak kaldığını, bazılarının ise β-tabaka haline geldiğini göstermektedir.Bu nedenle, NMR spektroskopisinin sonuçları, NT'nin hidrojel oluşumu için önemli olduğunu ve ayrıca 2Rep ve CT ile füzyon üzerine bir β-tabaka konformasyonuna dönüştüğünü göstermektedir.Bununla tutarlı olarak yakın zamanda amiloid uzamsal fermuarların muhtemelen NT alanının beş sarmalının hepsinde oluştuğunu ve Waltz algoritmasının sarmal 1'de bir amiloidojenik bölge öngördüğünü bulduk (Şekil 4e).
37°C'de inkübasyondan önce (mavi) ve 19 saat sonra (kırmızı) 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT çözeltisinin 2D spektrumları.Kırmızı spektrumdaki bireysel çapraz tepe noktaları ve mavi spektrumdaki F24, G136, polyA, tek harfli amino asit sembolleri ve kalıntı numaralarıyla gösterilir.Ekler, NT, 2Rep ve CT alanlarından seçilen kalıntılar için sinyal yoğunluğunun zamana bağımlılığını gösterir.b His-NT2RepCT hidrojellerinin katı hal radyofrekans (RFDR) spektrumları.RFDR spektrumlarında gözlenen Ca/Cβ kalıntılarının korelasyonları, model peptit kimyasal kaymaları ve istatistiklerden82,83 elde edilen değerler ve bunların ikincil yapılarıyla karşılaştırılarak belirlendi.SSB – dönen yan bant.c 37 °C'de 36 saat süreyle inkübasyon sırasında 15N-HSQC 10 mg/mL NT çözeltisinin tek boyutlu spektrumları.Ek, zamana karşı hacimsel yoğunluğu gösterir.d NT hidrojellerin katı hal RFDR spektrumları.RFDR spektrumlarında gözlenen Ca/Cβ kalıntılarının ve bunların ikincil yapılarının korelasyonları belirtilmiştir.e Fermuar veritabanındaki (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 fibrilasyon eğilim profiline dayanmaktadır.Hekzapeptidin uzaysal yıldırım kayması penceresinin Rosetta enerjisi kcal/mol cinsinden gösterilir.Kırmızı çubuklar, yüksek fibroz eğilimi olan heksapeptidleri belirtir (Rosetta enerjisi -23 kcal/mol'ün altında; noktalı çizginin altında).Yeşil çubuklar, Rosetta enerjileri eşiğin üzerinde olan ve dolayısıyla sterik fermuar oluşturma olasılıklarının daha düşük olduğu parçaları gösterir.Prolin içeren parçalar analizin dışında bırakıldı (sütunlar olmadan).Kareler, Waltz algoritması81 (https://waltz.switchlab.org) tarafından tahmin edilen amiloidoz alanlarını gösterir.NT'nin amino asit kalıntılarının dizisi en üsttedir ve β ikincil yapısında bulunan kalıntı türleri (katı hal NMR spektroskopisi ile belirlenir) kırmızıyla gösterilmiştir.Beş NT a-helisinin konumları (H1-H5)28 olarak gösterilmiştir.
pH <6,5'te HT dimerleşerek ısıya veya ürenin neden olduğu denatürasyona karşı dirençli olur18.NT dimerizasyonunun ve stabilitesinin jelleşmeyi nasıl etkilediğini açıklamak için, 100 mg/ml NT içeren çözeltiler, şişe ters çevirme testi kullanılarak pH 8, 7 ve 6'da kontrol edildi.pH 8 ve 7'de inkübe edilen NT numuneleri, 37 °C'de 30 dakika sonra jelleşti, ancak pH 8 jeli berrak kalırken, pH 7 jeli görünür bir çökelti gösterdi (Şekil 5a).Buna karşılık, pH 6'da HT içeren bir çözelti jel oluşturmadı ve 37°C'de 20 dakika sonra büyük bir çökelti görülebildi.Bu, dimerlerin kendilerinin ve/veya monomerlere kıyasla daha yüksek stabilitelerinin jelleşmeyi önlediğini göstermektedir.pH 7 ve 6'da NT için bir çökelti oluşması beklenmiyordu, çünkü NT'nin 200 mg/ml27'de çözünür olduğu, ısıyla denatürasyondan sonra kolayca yeniden katlandığı ve ayrıca daha düşük değerlerde bir a-sarmalını koruduğu rapor edildi. pH 18. Bu tutarsızlıklar için olası bir açıklama, daha önce bildirilen deneylerin oda sıcaklığında veya altında veya nispeten düşük protein konsantrasyonlarında16,18,19 gerçekleştirilmiş olmasıdır.
37°C'de inkübasyonun ardından pH 8, 7, 6 ve 154 mM NaCl'de (pH 8) NT flakon ters çevirme testi (100 mg/mL).b Sırasıyla 154 mM NaF ve 154 mM NaCl içeren ve içermeyen NT CD spektrumları.222 nm'deki molar eliptiklik, doğal kıvrımların bir kısmına dönüştürülür.c NT ters çevirme testi (100 mg/mL) NT* (37 °C ve 60 °C), NTA72R (37 °C) ve His-NT-L6 (37 °C ve 60 °C).d NT mutantları NT*, NTA72R ve His-NT-L6'nın CD spektrumları.222 nm'deki molar eliptiklik, doğal kıvrımların bir kısmına dönüştürülür.e NTFISp, NTMiSp ve azaltılmış NTMiSp'nin (100 mg/mL) inversiyon testi.Ölçek çubuğu 5 mm.f NT, NTFISp, NTMiSp ve azaltılmış NTMiSp'nin CD spektrumları.222 nm'deki molar eliptiklik, doğal kıvrımların bir kısmına dönüştürülür.25 °C ve 95 °C'deki tam NT spektrumları Ek Şekil 8'de gösterilmektedir.
Fizyolojik tuz konsantrasyonu, NT alt birimleri arasındaki elektrostatik etkileşimleri ve NT transferinin daha düşük pH18'e dimerizasyonunu belirler.154 mM NaCl ve NaF varlığının gerçekten de jelleşmeyi engellediğini bulduk (Şekil 5a, b; Ek Şekil 2b) ve bu tuzların NT monomerlerinin termal stabilitesini arttırdığını (Şekil 5b, Ek Şekil 8) .Aynı zamanda dimerizasyondan ziyade stabilite artışının jel oluşumunu önlediğini de öne sürmektedir.
Protein dimerizasyonunun ve jelleşmedeki stabilitenin rolünü daha fazla araştırmak için, yine düşük pH 28,30'da monomerik kalan iki mutant, NT* ve NTA72R kullandık.NT*, monomerin görünür dipolar yük dağılımının düzleştirildiği, dimerizasyonu önleyen ve monomer stabilitesini büyük ölçüde artıran çift yüklü bir ters mutanttır.NTA72R yüklü bir dipoldür ancak Arg-ikameli Ala dimer sınırında yer alır, dolayısıyla mutasyonlar dimerizasyon için gerekli alt birim etkileşimlerine müdahale eder.37°C'de inkübasyonun ardından NT* bir hidrojel oluşturmazken, NTA72R 15 dakika boyunca opak bir jel oluşturdu (Şekil 5c).Hem NT* hem de NTA72R dimerleşemediğinden ancak monomer stabilitesi farklı olduğundan (Şekil 5d), bu sonuçlar yüksek termodinamik stabilitenin NT'nin jelleşmesini önlediğini kuvvetle önerir.Bu aynı zamanda HT*'nin yüksek sıcaklıkta kararsız olduğunda (60°C'de 8 dakika sonra; Şekil 5c) bir jel oluşturması gerçeğiyle de desteklenir.NT'deki yüksek metiyonin içeriğinin doğal katlanmasını sıvılaştırdığı ve altı Met ila Leu ikamesinin (burada His-NT-L6 olarak anılacaktır) NT46 monomerini güçlü bir şekilde stabilize ettiği daha önce gösterilmiştir.NT jel oluşumu için yapısal esnekliğin gerekli olduğu varsayımına dayanarak, His-NT-L6 stabil mutantının 37 °C'de jelleşmediğini bulduk (Şekil 5c, d).Bununla birlikte His-NT-L6 da 60°С'de 60 dakika süreyle inkübasyonun ardından bir jel oluşturdu (Şekil 5c).
NT'nin β-tabaka yapılarına dönüşme ve hidrojeller oluşturma yeteneği, spidroinin NT alanlarının tamamı olmasa da bazıları için geçerli gibi görünmektedir.Farklı ipek türlerinden ve örümcek türlerinden Trichonephila clavipes'e (NTFlSp) ait NT'ler, nispeten düşük metionin içeriğine ve yüksek termal stabiliteye rağmen jeller oluşturmuştur (Şekil 5e, f ve Ek Tablo 2).Buna karşılık, düşük termal stabiliteye ve yüksek metiyonin içeriğine sahip Araneus ventricosus'tan (NTMiSp) küçük ampullar protein spidroinden gelen NT, hidrojeller oluşturmadı (Ek Tablo 2 ve Şekil 5e, f).İkincisi molekül içi disülfit bağlarının29,47 varlığıyla ilişkili olabilir.Tutarlı bir şekilde, NTMiSp'nin disülfit bağları azaldığında, 37°C'de 10 dakika inkübasyonun ardından bir hidrojel oluşturdu (Şekil 5e).Sonuç olarak, NT'den bir jel oluşumu için yapısal esnekliğin önemli ancak tek kriter olmadığı belirtilmelidir.İlgili olabilecek diğer bir faktör amiloid fibrilleri oluşturma eğilimidir ve fermuar veri tabanı ve Waltz algoritması ile yapılan analiz, jel oluşturma yeteneği ile amiloidojenik bölgelerin varlığı ve ayrıca tahmin edilen bölgelerin kapsamı arasında bir korelasyon göstermiştir. sterik fermuarlar oluşturmak için.Bir korelasyon vardı (Ek Tablo 2 ve Ek Şekil 9).
NT'nin uygun koşullar altında fibriller oluşturma ve jeller oluşturma yeteneği, NT'nin diğer protein parçalarıyla füzyonlarının hala füzyon ortaklarının tam işlevine sahip jeller oluşturabileceğini varsaymamıza yol açtı.Bunu test etmek için NT'nin C terminaline sırasıyla yeşil floresan proteini (GFP) ve purin nükleosid fosforilazı (PNP) ekledik.Ortaya çıkan füzyon proteinleri, gösterilenlerle tutarlı olarak çok yüksek nihai verimlerle (His-NT-GFP ve His-NT-PNP için sırasıyla 150 mg/L ve 256 mg/L çalkalama şişesi kültürleri) E. coli'de eksprese edildi. NT'ye kaynaşmış diğer proteinler için Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/mL) ve His-NT-PNP (100 mg/mL) füzyon proteinleri, 37°C'de 2 saat ve 6,5 saat sonra jeller oluşturdu ve daha da önemlisi, GFP fraksiyonu değişmeden kaldı.jelleşmeden sonra gözlendi, başlangıçtaki floresan yoğunluğunun>% 70'i jelleşmeden sonra kaldı (Şekil 6a).His-NT-PNP çözeltileri ve jellerindeki PNP aktivitesini ölçmek için füzyon proteinini NT ile seyreltmek zorunda kaldık çünkü saf preparatın enzimatik aktivitesi, jelleşme konsantrasyonlarında testin tespit aralığının dışındaydı.0,01 mg/mL His-NT-PNP ve 100 mg/mL NT içeren bir karışımla oluşturulan jel, önceden inkübe edilmiş numunelerin başlangıç ​​enzimatik aktivitesinin %65'ini korudu (Şekil 6b).Jel, ölçüm sırasında bozulmadan kaldı (Ek Şekil 10).
Görünür ışık ve UV ışığı altında His-NT-GFP'nin (300 mg/mL) ve His-NT-GFP hidrojeli (300 mg/mL) içeren ters çevrilmiş şişenin jelleşmesinden önce ve sonra bağıl floresans yoğunluğu.Noktalar bireysel ölçümleri (n = 3) gösterir, hata çubukları ise standart sapmayı gösterir.Ortalama değer hata çubuklarının ortasında gösterilir.b PNP aktivitesi, NT (100 mg/ml) ve 0.01 mg/ml his-NT-PNP ve 100 mg/ml Yeni Tayvan doları içeren bir karışımdan oluşan çözeltiler ve jeller kullanılarak florometrik analiz yoluyla elde edildi.Ekte His-NT-PNP (5 mm ölçek çubuğu) içeren bir hidrojel içeren ters çevrilmiş bir şişe gösterilmektedir.
Burada, bir protein çözeltisini 37°C'de inkübe ederek NT ve diğer rekombinant spidroin proteinlerinden hidrojel oluşumunu rapor ediyoruz (Şekil 1).Jelleşmenin α-helislerin β-katmanlarına dönüşümü ve amiloid benzeri fibrillerin oluşumu ile ilişkili olduğunu gösterdik (Şekil 3 ve 4).NT'ler, son derece yüksek çözünürlükleri ve 4°C'de birkaç gün boyunca >200 mg/mL konsantrasyonlarda yüksek stabiliteleriyle bilinen sarmal küresel beş sarmallı demetler olduğundan bu bulgu şaşırtıcıdır27.Ek olarak NT'ler, µM cinsinden düşük protein konsantrasyonlarında ısı denatürasyonundan sonra kolayca yeniden katlanır.Sonuçlarımıza göre fibril oluşumu >10 mg/mL protein konsantrasyonu ve hafif yüksek sıcaklık kombinasyonunu gerektirir (Şekil 1).Bu, amiloid fibrillerin fizyolojik koşullar48 altında termal dalgalanmalar nedeniyle kısmen katlanmamış durumda olan küresel olarak katlanmış proteinlerden oluşabileceği fikriyle tutarlıdır.Bu dönüşüme uğrayan proteinlerin örnekleri arasında insülin49,50, β2-mikroglobulin, transtiretin ve lizozim51,52,53 yer alır.NT doğal haliyle bir a-sarmal olmasına rağmen, polipeptit zincirinin yaklaşık %65'i sterik fermuar oluşumuyla uyumludur (Şekil 4e)45.Monomer dinamik olarak hareketli olduğundan46, bu potansiyel amiloidojenik bölgeleri orta derecede yüksek sıcaklıklarda açığa çıkarabilir ve yüksek toplam protein konsantrasyonlarında amiloid fibril oluşumu için kritik bir konsantrasyona ulaşabilir54.Bu mantığı takiben, spidroin konsantrasyonu ile jelleşme süresi arasında negatif bir korelasyon bulduk (Şekil 1c) ve eğer monomerik NT konformasyonu mutasyonlar (NT*, His-NT-L6) veya tuz ilavesi ile stabilize edilirse, bu durum önlenebilir. hidrojel oluşumu (Şekil 5).
Çoğu durumda amiloid fibriller çökelti olarak çözeltiden kaybolur, ancak belirli koşullar altında hidrojeller55,56,57 oluşturabilirler.Hidrojel oluşturan fibriller tipik olarak yüksek bir en boy oranına sahiptir ve moleküler dolaşma yoluyla stabil üç boyutlu ağlar oluşturur,55,58 sonuçlarımızla tutarlıdır.İn vitro hidrojel oluşumu için, proteinler genellikle tamamen veya kısmen, örneğin organik çözücülere, yüksek sıcaklığa (70–90°C) ve/veya düşük pH'a (1,5–3,0)59,60,61,62 maruz bırakılarak açılır.Burada açıklanan spidroin hidrojelleri sert işlemler gerektirmez ve hidrojelleri stabilize etmek için çapraz bağlama maddeleri gerektirmez.
Daha önce, ipek eğirme sırasında β-tabaka değişimine maruz kalan spidroin tekrarlarının ve QD'lerin hidrojeller oluşturduğu bildirilmişti.Bulgularımızla karşılaştırıldığında, kuluçka süreleri ve/veya kuluçka sıcaklıkları sırasıyla önemli ölçüde daha uzun veya daha yüksekti ve elde edilen hidrojeller genellikle opaktı (Şekil 7 ve Ek Tablo 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Hızlı jel sürelerine ek olarak, >300 mg/mL (%30) NT hidrojelleri, tarif edilen tüm diğer rekombinant örümcek ipeği proteini hidrojellerinin yanı sıra jelatin, aljinat (%2), agar (%0,5) gibi doğal hidrojellerden daha iyi performans gösterdi. ) ve kolajen.(%0,6) (Şekil 7 ve Ek Tablo 1 ve 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Bu çalışmadaki hidrojellerin jel süresi ve elastik modülü, diğer spidroin bazlı hidrojeller ve seçilmiş doğal hidrojellerle karşılaştırıldı.Referanslar, jelleşme koşullarının bir açıklamasıyla birlikte verilmiştir.APS Amonyum persülfat, oda sıcaklığı.Veri 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Örümcekler, depolama sırasında spidroinin jelleşmesini önlemek için yöntemler geliştirmiş gibi görünüyor.İpek bezindeki yüksek protein konsantrasyonuna rağmen, terminal alanıyla ilişkili geniş tekrar bölgesi, bezdeki görünen NT ve CT konsantrasyonunun, bu çalışmanın sınırında yaklaşık 10-20 mg/ml'ye karşılık geldiği anlamına gelir.in vitro gözlemlenen hidrojel oluşumu için gereklidir.Ek olarak, benzer tuz konsantrasyonları 16, ipek bezlerinde olduğu gibi NT'yi stabilize etti (Şekil 5b).NT konformasyonu E. coli sitozolünde incelenmiş ve in vitro incelendiğinde daha sıkı katlanmış olduğu bulunmuştur; bu da tuzun veya diğer faktörlerin bunun in vivo toplanmasını engellediğini gösterir.Bununla birlikte, NT'lerin β-tabakalı fibrillere dönüşme yeteneği filaman oluşumu için önemli olabilir ve gelecekteki çalışmalarda araştırılmalıdır.
Bu çalışmada gözlemlenen NT-amiloid benzeri fibril ve hidrojel oluşumunun yeni yönlerine ek olarak, bu olgunun biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalara sahip olabileceğini de gösterdik (Şekil 8).Kavramın bir kanıtı olarak NT'yi GFP veya PNP ile birleştirdik ve füzyon proteininin 37 °C'de inkübe edildiğinde hidrojeller oluşturduğunu ve GFP ve PNP fraksiyonlarının jelleşme sonrasında aktivitelerini büyük ölçüde koruduğunu gösterdik (Şekil 6).Nükleosid fosforilazlar, nükleosid analoglarının sentezinde önemli katalizörlerdir75, bu da keşfimizi biyofarmasötik endüstrisi için anlamlı kılmaktadır.Uygun koşullar altında şeffaf hidrojeller oluşturan füzyon proteinlerinin eksprese edilmesi kavramı, enzim immobilizasyonu, kontrollü ilaç salımı ve doku mühendisliği gibi çok çeşitli uygulamalar için uygun özelliklere sahip işlevselleştirilmiş hidrojellerin oluşturulmasına olanak tanır.Ek olarak, NT ve NT* etkili ekspresyon belirteçleridir30; bu, NT ve varyantlarının, çözünür füzyon proteinlerinin yüksek verimli üretimi ve ardından 3D hidrojellerde hareketsizleştirilmiş hedef proteinlerin oluşturulması için kullanılabileceği anlamına gelir.
NT çözünür, a-heliseldir ve düşük konsantrasyonlarda (μM) ve 37°C'de stabildir.Aynı sıcaklıkta, ancak artan konsantrasyonlarda (>10 mg/ml), NT, amiloid benzeri fibrillerden oluşan jeller oluşturur.NT füzyon proteinleri ayrıca tamamen işlevsel füzyon parçalarına sahip fibril jeller oluşturarak çeşitli proteinlerin NT kullanılarak 3D hidrojellerde immobilize edilmesine olanak tanır.Altta: NT (PDB: 4FBS) ve fiber ağları ile ilgili protein yapılarının çizimleri (varsayılan ve ölçeğe göre çizilmemiş, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Yapılar (amino asit dizilerini içeren tam bir liste için Ek Tablo 4'e bakınız) pT7 plazmitine klonlandı ve E. coli BL21'e (DE3) dönüştürüldü.Tasarlanmış plazmidler içeren E. coli, kanamisin (70 mg/1) ile desteklenmiş Luria et suyuna aşılandı ve gece boyunca 30°C'de ve 250 rpm'de büyütüldü.Kültür daha sonra kanamisin içeren LB ortamına 1/100 oranında aşılandı ve OD600 0.8'e ulaşana kadar 30°C'de ve 110 rpm'de kültürlendi.NMR çalışmaları için bakteriler, izotoplarla protein etiketlemesi için 2 g D-glikoz 13C (Aldrich) ve 1 g amonyum klorür 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) içeren M9 minimal ortamında büyütüldü.Sıcaklığı 20 santigrat dereceye düşürün ve 0,15 mM izopropiltiyogalaktopiranosid (son konsantrasyon) ile protein ekspresyonunu indükleyin.Gece boyunca protein ekspresyonunun ardından hücreler, 7278 xg'de, 4°C'de 20 dakika süreyle toplandı.Hücre peletleri 20 mM Tris-HCl, pH 8 içerisinde yeniden süspanse edildi ve bir sonraki kullanıma kadar donduruldu.Çözdürülmüş hücreler, 30 kPa'da bir hücre bozucu (TS serisi makineler, Constant Systems Limited, İngiltere) kullanılarak parçalandı.Daha sonra lizatlar 25.000 g'de 30 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlendi.NTMiSp için pelet daha sonra 2 M üre, 20 mM Tris-HCl, pH 8 içerisinde yeniden süspanse edildi ve 2 dakika boyunca sonikasyona tabi tutuldu (2 saniye açık/kapalı, %65), ardından 25.000 xg'de, 4°C'de tekrar santrifüjlendi. 30 dk.Süpernatan bir Ni-NTA kolonuna yüklendi, 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8 ile yıkandı ve son olarak protein, 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8 ile elüt edildi. NT2RepCT oluşturmak için ve NTCT, trombin sindirimi His ve NT arasındaki bölgeyi (ThrCleav) tanıtır.Trombin bölünme bölgeleri ayrıca His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep üretir), His-tiyoredoksin-ThrCleav-NT (NT üretir), His-tiyoredoksin-ThrCleav-CT (CT üretir), His-Tiyoredoksin-ThrCleav-NT'de de mevcuttur. .* (NT* üretir), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R üretir), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp üretir) ve His-Sülfür Redoksin-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp üretir).Yapılar trombin (1:1000) ile sindirildi ve gece boyunca 4°C'de 20 mM Tris-HCl, pH 8 ile, molekül ağırlığı eşiği 6-8 kDa olan bir Spectra/Por diyaliz membranı kullanılarak diyaliz edildi.Diyalizden sonra çözelti bir Ni-NTA kolonuna yüklenir ve ilgili proteini içeren atık madde toplanır.Üreticinin protokolüne göre Bradford tahlilini kullanan NTF1Sp hariç, her proteinin yok olma katsayısı kullanılarak 280 nm'de UV absorbansı ölçülerek protein konsantrasyonları belirlendi.Saflık, SDS poliakrilamid (%4-20) jel elektroforezi ve Coomassie parlak mavi boyama ile belirlendi.Proteinler, 20 dakikalık döngülerde 10 kDa moleküler ağırlık kesme değeriyle 4000 xg'de santrifüj filtreleri (VivaSpin 20, GE Healthcare) kullanılarak konsantre edildi.
Protein çözeltisini çözün ve 1 ml'lik şeffaf bir septum şişesine (8 x 40 mm Thermo Scientific) dikkatlice 150 ul pipetleyin.Buharlaşmayı önlemek için tüplerin kapakları parafilm ile kapatılmıştır.Numuneler (n = 3) 37°C veya 60°C'de inkübe edildi ve jelleşmeyi gözlemlemek için periyodik olarak ters çevrildi.Jelleşmeyen numuneler en az bir hafta süreyle inkübe edildi.10 μM protein başına 10 mM DTT ile NTMiSp disülfit bağlarını azaltın.Doğal örümcek ipeği kaplamalarının jelleşmesini analiz etmek için İsveç köprü örümceği kesildi, iki ana ampullü bez 200 ul 20 mM Tris-HCl tampon pH 8'e yerleştirildi ve kaplamanın bezlerden ayrılmasına izin verecek şekilde kesildi..Bezlerin içeriği, kuru ağırlığın belirlenmesi için 50 ul (açık şişelerin 60 °C'de sabit ağırlığa kadar inkübasyonuyla) ve 37 °C'de jelasyon için 150 ul tampon içinde çözülür.
Ölçüm geometrisi/alet, üst çapı 20 mm ve aralığı 0,5 mm olan paralel bir plaka kullanılarak paslanmaz çelikten yapılmıştır.Paslanmaz çelik tabanlı bir Peltier plaka kullanarak numuneyi 25 °C'den 45 °C'ye ve dakikada 1 °C'lik bir hızla tekrar 25 °C'ye ısıtın.Titreşim ölçümleri 0,1 Hz frekansta ve malzemenin doğrusal viskoelastik bölgesinde 100 mg/mL ve 300-500 mg/mL numuneler için sırasıyla %5 ve %0,5 gerilimde gerçekleştirildi.Buharlaşmayı önlemek için özel bir nem odası kullanın.Veriler Prism 9 kullanılarak analiz edildi.
Oda sıcaklığında 800 ila 3900 cm–1 arasında kızılötesi (IR) spektrumların toplanması için.ATR cihazı ve spektrometreden geçen ışık yolu, deney öncesinde ve sırasında kuru filtrelenmiş hava ile temizlenir.Çözeltiler (spektrumdaki su emme zirvelerini en aza indirmek için 500 mg/mL) kristallerin üzerine pipetlendi ve ölçümden önce jeller (500 mg/mL) oluşturuldu ve ardından kristallere (n = 3) aktarıldı.2 cm-1 çözünürlük ve 2 sıfır görev döngüsü ile 1000 tarama kaydedildi. İkinci türev, dokuz noktalık bir yumuşatma aralığı kullanılarak OPUS (Bruker) kullanılarak hesaplandı.Spektrumlar, F. Menges “Spectragryph – Optik Spektroskopi Yazılımı” kullanılarak 1720 ile 1580 cm-1 arasındaki aynı entegrasyon bölgesine normalleştirildi.ATR-IR spektroskopisinde, bir kızılötesi ışının bir numuneye nüfuz etme derinliği dalga sayısına bağlıdır, bu da düşük dalga sayılarında yüksek dalga sayılarına göre daha güçlü absorpsiyonla sonuçlanır.Bu etkiler Şekil 1 ve 2'de gösterilen spektrumlar için düzeltilmemiştir.3 çünkü çok küçükler (Ek Şekil 4).Bu rakam için düzeltilmiş spektrumlar Bruker OPUS yazılımı kullanılarak hesaplandı.
Prensip olarak, amid I zirvesindeki bileşenlerin güvenilir şekilde dekonvolüsyonundan sonra protein konformasyonlarının kapsamlı bir ölçümü mümkündür.Ancak uygulamada bazı engeller ortaya çıkıyor.Spektrumdaki gürültü, ters evrişim sırasında (yanlış) tepe noktaları olarak görünebilir.Ek olarak, suyun bükülmesinden kaynaklanan tepe noktası, amid I tepe noktasının konumuyla çakışmaktadır ve burada incelenen sulu jel gibi büyük miktarda su içeren numuneler için benzer bir büyüklüğe sahip olabilir.Bu nedenle amid I zirvesini tamamen ayrıştırmaya çalışmadık ve gözlemlerimiz yalnızca NMR spektroskopisi gibi diğer yöntemleri desteklemek amacıyla değerlendirilmelidir.
50 mg/ml NT ve His-NT2RepCT çözeltileri gece boyunca 37°C'de jelleştirildi.Hidrojel daha sonra 20 mM Tris-HCl (pH 8) ile 12.5 mg/ml konsantrasyona kadar seyreltildi, iyice çalkalandı ve jeli kırmak için pipetlendi.Daha sonra hidrojel, 20 mM Tris-HCl (pH 8) ile 10 kez seyreltildi, 5 ul numune, formvar ile kaplanmış bir bakır ızgaraya uygulandı ve fazla numune, kurutma kağıdıyla çıkarıldı.Numuneler iki kez 5 ul MilliQ su ile yıkandı ve 5 dakika boyunca %1 uranil formatla boyandı.Fazla lekeyi emici kağıtla çıkarın, ardından ağı havayla kurutun.Görüntüleme, 100 kV'de çalışan bir FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN kullanılarak bu ızgaralar üzerinde gerçekleştirildi.Görüntüler, Veleta 2k × 2k CCD kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Almanya) kullanılarak x 26.500 ve x 43.000 büyütmelerde kaydedildi.Her örnek için (n = 1), 10-15 görüntü kaydedildi.Görüntü analizi ve lif çaplarının (n = 100, farklı lifler) ölçümü için ImageJ (https://imagej.nih.gov/) kullanıldı.Eşleştirilmemiş t-testlerini (iki kuyruklu) gerçekleştirmek için Prizma 9 kullanıldı.Ortalama His-NT2RepCT ve NT fibrilleri sırasıyla 11,43 (SD 2,035) ve 7,67 (SD 1,389) nm idi.Güven aralığı (%95) -4,246 ile -3,275 arasındadır.serbestlik derecesi = 198, p < 0,0001.
10 uM tioflavin T (ThT) içeren 80 ul sıvı numunesi, Corning 96 kuyucuklu siyah tabanlı şeffaf alt plakalar (Corning Glass 3881, ABD) kullanılarak statik koşullar altında üç kopya halinde (n = 3) ölçüldü.Floresans farklılıkları, 440 nm'lik bir uyarma filtresi ve 480 nm'lik bir emisyon filtresi (BMG Labtech, Offenburg, Almanya'dan FLUOStar Galaxy) kullanılarak kaydedildi.Farklı ThT konsantrasyonları ile deneyler, sinyal yoğunluğunu değiştirmeden gerçekleştirildiğinden, ThT sinyali ne doyuruldu ne de söndürüldü.Bulanıklık ölçümü için absorbansı 360 nm'de kaydedin.Tohumlama deneyleri için 37°C'de 100 mg/mL jeller oluşturuldu, yeniden süspanse edildi ve %5, %10 ve %20 molar oranlarında tohumlama için kullanıldı.Veriler Prism 9 kullanılarak analiz edildi.
His-NT2RepCT ve NT >100 mg/mL stoklarını buz üzerinde eritin ve 0,22 μm'lik bir filtreden filtreleyin.Konsantrasyonlar, Nanodrop kullanılarak 280 nm'de absorbans ölçülerek hesaplandı.Şeffaf tabanlı 96 oyuklu siyah bağlayıcı olmayan bir plakanın (Corning) kuyucuklarında, numuneler 20 mM Tris-HCl pH 8 içerisinde 20 mg/ml'ye seyreltildi ve 5 μM ThT (son konsantrasyon), toplam numune konsantrasyonu ile karıştırıldı. 50 ul hacim.Numuneler, ThT görüntüleme için iletilen ışık kanalı ve FITC uyarma ve emisyon filtre setlerine sahip bir CellObserver (Zeiss) mikroskobu üzerinde 37 °C'de her 10 dakikada bir görüntülendi.Görüntüleme için 20x/0,4 lens kullanılır.Görüntü analizi için Zen Blue (Zeiss) ve ImageJ (https://imagej.nih.gov/) kullanıldı.Jeller ayrıca 20 mM Tris pH 8 ve 5 uM ThT içeren 50 mg/mL konsantrasyonda NT ve His-NT2RepCT çözeltilerinden hazırlandı ve 37°C'de 90 dakika inkübe edildi.Jel parçaları, bağlayıcı olmayan siyah 96 oyuklu şeffaf alt plakada 20 mM Tris, pH 8 ve 5 μM ThT içeren yeni bir kuyucuğa aktarıldı.20x/0,4 büyütmede yeşil floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin.Görüntü analizi için ImageJ kullanıldı.
Çözüm NMR spektrumları, bir QCI Dört Kutuplu Rezonans Darbeli Gradyan Alan Kriyoprobu (HFCN) ile donatılmış bir 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometresi üzerinde 310 K'de elde edildi.20 mM Tris-HCl (pH 8), %0,02 (a/h) NaN3, %5 DO (h/h), (n = 1) içerisinde çözünmüş, 13C, 15N ile etiketlenmiş 10 mg/mL homojen protein içeren NMR numuneleri .NT2RepCT'nin pH 6,7'deki kimyasal kaymaları, 15N-HSQC'nin 2D spektrumunda zirve 23'ü atamak için kullanıldı.
13C, 15N etiketli hidrojellerin sihirli açılı dönen katı NMR (MAS) spektrumları, 3,2 mm 13C/15N{1H} elektronsuz probla donatılmış bir Bruker Avance III HD spektrometresinde 800 MHz'de kaydedildi.Numune sıcaklığı, 277 K'de değişken sıcaklıktaki bir gaz akışı kullanılarak kontrol edildi. İki boyutlu dipol dönme rezonansı (DARR)76 ve radyo frekansı yeniden bağlanma (RFDR)77 spektrumları, sırasıyla 12,5 kHz ve 20 kHz MAS frekanslarında elde edildi.1H'den 13C'ye çapraz polarizasyon (CP), 1H'de 60,0 ila 48,0 kHz, 13C'de 61,3/71,6 kHz (12,5/20 kHz MAS'ta) ve temas süresi 0,5-1 ms olan doğrusal bir rampa kullanılarak gerçekleştirildi.Veri toplama sırasında 73,5 kHz'de Spinal6478 dekuplajı kullanıldı.Edinme süresi 10 milisaniye ve döngü gecikmesi 2,5 saniyeydi.RFDR spektrumlarında gözlemlenen tek bağlantılı Ca/Cβ korelasyonları, DARR spektrumlarındaki karakteristik kalıntı tipi kimyasal kaymalara ve çoklu bağlantılı korelasyonlara dayalı olarak atandı.
NT, NTFlSp ve NTMiSp için çarpıntı eğilimlerini ve Rosetta enerjisini değerlendirmek için Fermuar79 veritabanı (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) kullanıldı.Fermuar veritabanı, protein yapısını modellemek ve analiz etmek için çeşitli serbest enerji fonksiyonlarını birleştiren Rosetta Energy80'i hesaplar.-23 kcal/mol veya daha düşük bir enerji seviyesi, fibrilasyon eğiliminin yüksek olduğunu gösterir.Daha düşük enerji, fermuar konformasyonunda iki β-iplikçiklerinin daha fazla stabilitesi anlamına gelir.Ek olarak NT, NTFISp ve NTMiSp Ref'deki amiloidojenik bölgeleri tahmin etmek için Waltz algoritması kullanıldı.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT protein çözeltisi, pH'ı sırasıyla pH 6 ve 7'ye düşürmek için pH 5.5 ve 6.0'da 2-(N-morfolino)etansülfonik asit (MES) tamponu ile karıştırıldı.Nihai protein konsantrasyonu 100 mg/ml idi.
Ölçümler, 0,1 cm optik yola sahip 300 μL'lik bir küvet kullanılarak bir J-1500 CD spektrometresinde (JASCO, ABD) yapıldı.Proteinler, 20 mM fosfat tamponunda (pH 8) 10 uM'ye (n = 1) seyreltildi.Tuz varlığında protein stabilitesini analiz etmek için proteinler, sırasıyla 154 mM NaF veya NaCl içeren 20 mM fosfat tamponunda (pH 8) aynı konsantrasyonda (n = 1) analiz edildi.Sıcaklık taramaları 222 nm'de 25°C'den 95°C'ye ve 1°C/dakika ısıtma hızıyla kaydedildi.Doğal olarak katlanmış proteinlerin oranı, (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) formülü kullanılarak hesaplandı.Ek olarak, her numune için 25°C'de ve 95°C'ye ısıtıldıktan sonra 260 nm'den 190 nm'ye kadar beş spektrum kaydedildi.Beş spektrumun ortalaması alındı, düzeltildi ve molar eliptikliğe dönüştürüldü.Veriler Prism 9 kullanılarak analiz edildi.
His-NT-GFP'nin (300 mg/mL, 80 µL) floresans yoğunluğu, statik koşullar altında siyah şeffaf tabanlı (Corning Glass 3881, ABD) 96 oyuklu Corning plakalarında üç kopya halinde (n = 3) ölçüldü.Numuneleri 395 nm uyarma dalga boyuna sahip floresan bazlı bir plaka okuyucuyla ölçün ve emisyonu jelleşmeden önce 509 nm'de ve 2 saat sonra 37°C'de kaydedin.Veriler Prism 9 ile analiz edildi.
Üreticinin talimatlarına göre purin nükleosid fosforilaz aktivite tahlil kiti (florometrik yöntem, Sigma Aldrich) kullanıldı.Jellerdeki ve His-NT-PNP içeren solüsyonlardaki aktiviteyi ölçmek için, 10 ng His-NT-PNP'yi 100 mg/mL NT ile toplam 2 μL hacme kadar karıştırın çünkü jel, setin tespit aralığının üzerinde bir sinyal verdi.His-NT-PNP'siz jeller ve solüsyonlara yönelik kontroller dahil edildi.Ölçümler iki kez yapıldı (n = 2).Aktivite ölçüldükten sonra reaksiyon karışımı çıkarıldı ve ölçüm sırasında jelin bozulmadan kalmasını sağlamak için jelin fotoğrafı çekildi.Veriler Prism 9 kullanılarak analiz edildi.
Çalışma tasarımı hakkında daha fazla bilgi için bu makaleyle bağlantılı Doğa çalışmasının özetine bakın.
Şekil 1 ve 2 başlangıç ​​verilerini göstermektedir.1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f ve 6, Ek Şekiller.3, ek şek.5a, d, ek şekil.6 ve ek şek.8. Veriler Bu çalışmadan elde edilen veriler https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 Zenodo veritabanında barındırılmaktadır.Bu çalışmada elde edilen NMR verileri BMRBig deposuna bmrbig36 giriş kimliği altında gönderildi.GFP ve PNP'nin yapıları PDB'den alınmıştır (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. ve Johansson, J. Spinning suni örümcek ipeği.Ulusal Kimya.Biyoloji.11, 309–315 (2015).
Babb, PL ve ark.Nephila clavipes genomu, örümcek ipeği genlerinin çeşitliliğini ve bunların karmaşık ifadesini vurgulamaktadır.Ulusal Genette.49, 895–903 (2017).