347 12.7*1.24mm Paslanmaz çelik sarmal boru, a-sinüklein ve tau'nun senkron elektrostatik yoğunlaşma ve koagregasyonunun moleküler mekanizması

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Sınırlı CSS desteğine sahip bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Ayrıca sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Slayt başına üç makale gösteren kaydırıcılar.Slaytlar arasında ilerlemek için geri ve ileri düğmelerini veya her slaytta ilerlemek için sondaki slayt denetleyici düğmelerini kullanın.

347 Paslanmaz Çelik Boru Şartnamesi

347 12,7*1,24 mm Paslanmaz çelik sarmal boru

Dış Çap: 6,00 mm Dış Çap, 914,4 mm Dış Çapa kadar, 24 inçe kadar boyutlar NB stokta mevcuttur, Dış Çapta Çelik Borular stokta mevcuttur

SS 347 Boru Kalınlık Aralığı: 0,3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, vb. (0,5-12 mm) Veya gerektiği gibi uyarlanacak normal olmayan boyut

Tür: SS 347 Dikişsiz Borular |SS 347 ERW Borular |SS 347 Kaynaklı Borular |SS 347 Fabrikasyon Borular |SS 347 CDW Borular, LSAW Borular / Dikiş kaynaklı / Yeniden Çizilmiş

Form: SS 347 Yuvarlak Borular/Tüpler, SS 347 Kare Borular/Tüpler, SS 347 Dikdörtgen Boru/Tüpler, SS 347 Kangal Borular, SS 347 “U” Şekli, SS 347 Tava Kek Ruloları, SS 347 Hidrolik Borular

Uzunluk: Tek Rastgele, Çift Rastgele ve Gerekli Uzunluk Uç: Düz Uç, Eğimli Uç, Dişli

Uç Koruması: Plastik Kapaklar |Dış Kaplama: 2B, No.4, No.1, No.8 Paslanmaz Çelik Borular için Ayna Kaplama, müşteri gereksinimlerine göre kaplama

Teslimat Durumu: Tavlanmış ve Turşulanmış, Cilalı, Parlak Tavlı, Soğuk Çekilmiş

Muayene, Test Raporları: Değirmen Test Sertifikaları, EN 10204 3.1, Kimyasal Raporlar, Mekanik Raporlar, PMI Test Raporları, Görsel Muayene Raporları, Üçüncü Taraf Muayene Raporları, NABL Onaylı Laboratuar Raporları, Tahribatlı Test Raporu, Tahribatsız Test Raporları

Ambalaj: Ahşap Kutularda, Plastik Torbalarda, Paketlenmiş Çelik Şeritlerde veya Müşterilerin İsteklerine Göre Paketlenir

Özel Ürünler: Yukarıdakilerin dışındaki ölçü ve özellikler istek üzerine üretilebilir.

SS 347 Boru Boyutu Aralığı: 1/2 inç NB, OD ila 24 inç

ASTM A312 347: Yüksek sıcaklık ve genel aşındırıcı hizmet için tasarlanmış dikişsiz ve düz dikişli kaynaklı östenitik boru.Kaynak sırasında ilave metale izin verilmez.

ASTM A358 347: Aşındırıcı ve/veya yüksek sıcaklıktaki servisler için elektrik füzyon kaynaklı östenitik boru.Tipik olarak bu spesifikasyona göre yalnızca 8 inç'e kadar olan borular üretilir.Kaynak sırasında ilave metal eklenmesine izin verilir.

ASTM A790 347: Genel korozif hizmet için tasarlanmış dikişsiz ve düz dikişli kaynaklı ferritik/östenitik (dubleks) boru, özellikle stresli korozyon çatlamasına karşı dirence vurgu yapılmaktadır.

ASTM A409 347: Korozif ve/veya yüksek korozyona dayanıklı Sch5S ve Sch 10S duvarlı, 14" ila 30" boyutlarında düz dikişli veya spiral dikişli elektrikli füzyon kaynaklı büyük çaplı östenitik hafif duvarlı boru

ASTM A376 347: Yüksek sıcaklık uygulamaları için dikişsiz östenitik boru.

ASTM A813 347: Yüksek sıcaklık ve genel korozif uygulamalar için tek dikişli, tek veya çift kaynaklı östenitik boru.

ASTM A814 347: Yüksek sıcaklık ve genel aşındırıcı hizmet için soğuk işlenmiş kaynaklı östenitik boru.

347H Paslanmaz Çelik Borular Kimyasal Bileşimi

Paslanmaz Çelik 347H Boru Mekanik Özellikleri

Paslanmaz Çelik 347H Boruların Fiziksel Özellikleri

347H Paslanmaz Çelik Boru için Eşdeğer Kaliteler

Amiloid alfa-sinüklein (αS) toplanması, Parkinson hastalığının ve diğer sinükleinopatilerin ayırt edici özelliğidir.Son zamanlarda, yaygın olarak Alzheimer hastalığıyla ilişkilendirilen tau proteini, aS patolojisiyle ilişkilendirilmiş ve iki proteinin koagregasyonunun moleküler mekanizması belirsiz kalmasına rağmen, aS açısından zengin kapanımlarda birlikte lokalize olduğu bulunmuştur.Burada αS fazının, tau gibi pozitif yüklü polipeptitlerle elektrostatik kompleks yoğunlaşması yoluyla sıvı yoğunlaşmalara ayrıldığını rapor ediyoruz.αS'nin polikatyonlara olan afinitesine ve pıhtılaşma ağının değerlik tükenme hızına bağlı olarak, pıhtılar hızlı jelleşmeye veya birleşmeye ve ardından yavaş amiloid toplanmasına maruz kalır.Bir dizi gelişmiş biyofiziksel tekniği birleştirerek, sıvı-sıvı aS/Tau faz ayrımını karakterize edebildik ve sıvı protein yoğunlaşmasında her iki proteini de içeren heterojen agregatların oluşumuna yol açan temel faktörleri tanımlayabildik.
Membran bölmelerine ek olarak, hücrelerdeki mekansal ayırma, sıvı-sıvı faz ayrımı (LLPS) olarak bilinen bir işlem yoluyla, biyomoleküler yoğunlaşmalar veya damlacıklar adı verilen protein açısından zengin, sıvı benzeri yoğun cisimlerin oluşmasıyla da sağlanabilir.Bu damlacıklar, genellikle proteinler veya proteinler ile RNA arasındaki çok değerlikli zamansal etkileşimlerle oluşur ve neredeyse tüm canlı sistemlerde çeşitli işlevlere hizmet eder.Çok sayıda LLP özellikli protein, doğası gereği ve biyomoleküler yoğunlaşmaların3,4,5 oluşumunda oldukça düzensiz olan düşük karmaşıklığa sahip diziler sergiler.Çok sayıda deneysel çalışma, bu sıvı benzeri yoğunlaşmaları oluşturan proteinlerin esnek, sıklıkla düzensiz ve çok değerlikli doğasını ortaya çıkarmıştır; ancak bu yoğunlaşmaların daha katı benzeri bir yapıya dönüşmesini ve büyümesini kontrol eden spesifik moleküler belirleyiciler hakkında çok az şey bilinmektedir. durum..
Yeni veriler, anormal protein kaynaklı LLPS'nin ve damlacıkların katı yapılara dönüşmesinin, genellikle dejeneratif hastalıkların ayırt edici özelliği olan çözünmeyen toksik agregatların oluşumuna yol açan ilgili hücresel yollar olabileceği hipotezini desteklemektedir.Çoğu zaman yüksek oranda yüklü ve esnek olan birçok LLPS ile ilişkili doğası gereği düzensiz protein (IDP), amiloid toplanması süreci yoluyla uzun süredir nörodejenerasyonla ilişkilendirilmiştir.Özellikle, FUS7 veya TDP-438 gibi biyomoleküler IDP yoğunlaşmalarının veya hnRNPA19 gibi düşük karmaşıklığa sahip büyük alanlara sahip proteinlerin, akışkanlaştırma adı verilen bir işlem yoluyla jel benzeri ve hatta katı formlara yaşlandığı gösterilmiştir.birleştirmek.zamanın bir fonksiyonu olarak veya belirli translasyon sonrası değişikliklere veya patolojik olarak önemli mutasyonlara yanıt olarak katı faz geçişine (LSPT)1,7.
İn vivo LLPS ile ilişkili diğer bir IDP, amiloid agregasyonu Alzheimer hastalığında10 fakat aynı zamanda yakın zamanda Parkinson hastalığında (PD) ve diğer sinaptik nükleer proteinopatilerde11, 12, 13 ilişkili olduğu düşünülen mikrotübül ile ilişkili düzensiz bir protein olan Tau'dur.Tau'nun uygun elektrostatik etkileşimler14 nedeniyle çözelti/sitoplazmadan kendiliğinden ayrıştığı, bunun sonucunda elektrostatik koaservatlar olarak bilinen tau açısından zengin damlacıkların oluştuğu gösterilmiştir.Bu tür spesifik olmayan etkileşimin, doğadaki birçok biyomoleküler yoğunlaşmanın arkasındaki itici güç olduğu da gözlemlenmiştir15.Tau proteini durumunda, elektrostatik agregasyon, proteinin zıt yüklü bölgelerinin bölünme sürecini tetiklediği basit agregasyonla veya RNA gibi negatif yüklü polimerlerle etkileşim yoluyla karmaşık agregasyonla oluşturulabilir.
Son zamanlarda, PH ve topluca sinükleinopati17,18 olarak bilinen diğer nörodejeneratif hastalıklarda rol oynayan bir amiloid IDP olan α-sinükleinin (αS), sıvı benzeri davranışa sahip protein yoğunlaşmalarında yoğunlaşan hücresel ve hayvan modellerinde19,20 gösterilmiştir.In vitro çalışmalar, aS'nin ağırlıklı olarak hidrofobik etkileşimler yoluyla basit toplama yoluyla LLPS'ye maruz kaldığını göstermiştir, ancak bu işlem son derece yüksek protein konsantrasyonları ve atipik olarak uzun kuluçka süreleri gerektirse de19,21.İn vivo gözlemlenen aS içeren yoğunlaşmaların bu veya diğer LLPS süreçleri tarafından oluşturulup oluşturulmadığı, çözülmemiş önemli bir sorun olmaya devam etmektedir.Benzer şekilde, Parkinson hastalığı ve diğer sinükleinopatilerdeki nöronlarda aS amiloid toplanması gözlemlenmiş olsa da, aS'nin hücre içi amiloid toplanmasına uğradığı kesin mekanizma belirsizliğini koruyor çünkü bu proteinin aşırı ekspresyonu bu süreci tek başına tetikliyor gibi görünmüyor.Hücre içi aS amiloid düzeneklerinin yeniden çekirdeklenmesi için belirli hücresel konumların veya mikro ortamların gerekli olduğunu düşündüren ek hücresel hasar sıklıkla gereklidir.Agregasyona özellikle eğilimli olan bir hücresel ortam, protein yoğunlaşmalarının 23 iç kısmı olabilir.
İlginç bir şekilde, aS ve tau'nun Parkinson hastalığı ve diğer sinükleinopatileri olan insanlarda karakteristik hastalık kapanımlarında birlikte lokalize olduğu bulunmuştur (24,25) ve deneyler, iki protein (26,27) arasında sinerjistik bir patolojik ilişki bildirmiştir; bu da aS ve agregasyon arasında potansiyel bir ilişki olduğunu düşündürmektedir. Nörodejeneratif hastalıklarda tau.hastalık.aS ve tau'nun etkileşime girdiği ve birbirlerinin in vitro ve in vivo28,29 toplanmasını teşvik ettiği bulunmuştur ve bu iki proteinden oluşan heterojen agregatlar, sinükleinopatili30 hastaların beyinlerinde gözlenmiştir.Ancak aS ve tau arasındaki etkileşimin moleküler temeli ve birlikte toplanmasının mekanizması hakkında çok az şey bilinmektedir.aS'nin, aS'nin oldukça negatif yüklü C-terminal bölgesi ile yine pozitif yüklü kalıntılar bakımından zengin olan tau'nun prolin açısından zengin merkezi bölgesi arasındaki elektrostatik çekim yoluyla tau ile etkileşime girdiği rapor edilmiştir.
Bu çalışmada, aS'nin, poli-L-lisin (pLK) gibi diğer pozitif yüklü polipeptitlerle etkileşiminin aksine, tau proteini varlığında elektrostatik kompleks yoğunlaşması yoluyla gerçekten de damlacıklara ayrışabildiğini ve bu süreçte gösterdiğimizi gösterdik.αS, damlacık ağı için bir iskele molekülü görevi görür.Koaservat ağında yer alan proteinlerin etkileşiminin değerliği ve gücündeki farklılıklarla ilişkili olan elektrostatik aS koaservatlarının olgunlaşma sürecinde gözle görülür farklılıklar belirledik.İlginç bir şekilde, uzun ömürlü sıvı koaservatlarda aS ve tau amiloid proteinlerinin birlikte toplandığını gözlemledik ve bu iki proteinin bu tür koaservatlarda birlikte toplanmasına yol açan bazı temel faktörleri belirledik.Burada, hastalığa özgü kapanımlarda iki proteinin birlikte lokalizasyonunun altında yatan olası bir moleküler mekanizma olan bu süreci ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
aS, nötr pH'ta oldukça anyonik bir C-terminal kuyruğuna sahiptir (Şekil 1a) ve elektrostatik komplekslerin polikatyonik düzensiz polipeptit molekülleri ile yoğunlaşması yoluyla LLPS'ye maruz kalabileceğini varsaydık.Nötr pH 32'de pozitif yüklü ve düzensiz polimerik yapısı nedeniyle başlangıç ​​modeli molekülü olarak 100 kalıntılı bir poli-L-lizin (pLK) kullandık. İlk olarak, pLK'nin, Çözelti NMR spektroskopisi yoluyla αS'nin Ct alanıyla etkileşime girdiğini doğruladık. (Şekil 1b), artan aS:pLK molar oranlarının varlığında 13C/15N etiketli aS kullanılarak.pLK'nin aS'nin Ct alanı ile etkileşimi, kimyasal kaymadaki bozulmalarda ve proteinin bu bölgesindeki tepe yoğunluğunda bir azalmada kendini gösterir.İlginç bir şekilde, aS'yi pLK ile yaklaşık αS konsantrasyonunda karıştırdığımızda.Polietilen glikol (%5–15 PEG-8) varlığında 5–25 µM (tipik LLPS tamponu: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, %15 PEG-8) hemen geniş bir protein oluşumu alanına geçtik .damlacıklar, floresans (WF) ve parlak alan (BF) mikroskobu kullanılarak gözlendi (Şekil 1c).Konsantre αS içeren 1-5 µm damlacıklar (1 µM AlexaFluor488 etiketli αS, AF488-αS eklenmiştir), elektrostatik özellikleri %10 1,6-heksandiol (1,6-HD) direncinden ve NaCl konsantrasyonunda bir artış (Şekil 1c).aS/pLK elektrostatik kompleksinin koaservatlarının sıvı benzeri doğası, milisaniyeler içinde kaynaşma yetenekleriyle gösterilmektedir (Şekil 1d).Türbidimetri kullanarak, bu koşullar altında damlacık oluşumunu ölçtük, stabilitesiyle ilişkili ana etkileşimin elektrostatik doğasını doğruladık (Şekil 1e) ve çeşitli polimer oranlarının LLPS süreci üzerindeki etkisini değerlendirdik (Şekil 1f).Her ne kadar geniş bir polimer oranları aralığında damlacık oluşumu gözlemlense de, pLK'nin αS'yi aştığı durumlarda süreç çok uygundur.LLP'ler ayrıca kimyasal olarak farklı yer değiştirme maddesi dekstran-70 (70 kDa) kullanılarak veya cam slayt damlaları, çeşitli malzemelerden mikroplaka kuyuları, Eppendorf veya kuvars kılcalları dahil olmak üzere çeşitli numune formatları kullanılarak da gözlemlenmiştir.
Bu çalışmada kullanılan WT-αS ve ΔCt-αS varyantlarındaki farklı protein bölgelerinin şematik gösterimi.Amfipatik N-terminal alanı, hidrofobik amiloid oluşturucu (NAC) bölge ve negatif yüklü C-terminal alanı sırasıyla mavi, turuncu ve kırmızı renkte gösterilmiştir.WT-αS'nin Artık Başına Net Ücret (NCPR) haritası gösterilmektedir.b Makromoleküler kümelerin yokluğunda aS/pLK etkileşiminin NMR analizi.pLK konsantrasyonu arttıkça (1:0,5, 1:1,5 ve 1:10'luk aS:pLK molar oranları sırasıyla açık yeşil, yeşil ve koyu yeşil renkte gösterilir).c LLPS tamponunda (üstte) veya 500 mM NaCl (sol altta) ile desteklenmiş veya 10 dakikadan sonra αS/pLK'yi (molar oran 1:10) 25 µM'de (WF görüntüleme için 1 µM AF488 etiketli αS veya Atto647N etiketli pLK) koaserve edin. % 1,6-heksandiol (1,6-HD; sağ alt).Ölçek çubuğu = 20 µm.d 25 μM konsantrasyonda aS/pLK'nin (molar oran 1:10) BF damlacık füzyonunun temsili mikroskobik görüntüleri;oklar, bireysel damlaların (kırmızı ve sarı oklar) 200 ms içinde yeni bir damla (turuncu ok) halinde birleştirilmesini gösterir.Ölçek çubuğu = 20 µm.e Işık saçılımı (350 nm'de) 25 µM αS'de 500 mM NaCl veya %10 1,6-HD eklenmesinden önce ve sonra LLPS tamponunda aS/pLK toplanması (N = 3 numune kopyası, ortalama ve standart sapma da belirtilmiştir).f BF görüntüsü (üstte) ve artan αS:pLK molar oranıyla 25 μM αS'de αS/pLK toplanmasının ışık saçılım analizi (350 nm'de, altta) (N = 3 numune kopyası, ortalama ve standart sapma da belirtilmiştir).Ölçek çubuğu = 10 µm.Bir görüntüdeki ölçek çubuğu, bir paneldeki tüm görüntülerin ölçeğini gösterir.Ham veriler, ham veri dosyaları biçiminde sağlanır.
αS/pLK elektrostatik kompleks yoğunlaşmasına ilişkin gözlemlerimize ve tau31 ile doğrudan etkileşim yoluyla tau/RNA yoğunlaşmasının bir müşteri molekülü olarak αS'ye ilişkin önceki gözlemlerimize dayanarak, aS ve tau'nun RNA yokluğunda çözücü ile birlikte ayrışabileceğini varsaydık. yoğunlaşma.elektrostatik kompleksler yoluyla ve aS, aS/Tau koaservatlarındaki iskele proteinidir (Şekil 2e'deki tau yük dağılımına bakınız).10 μM αS ve 10 μM Tau441'in (sırasıyla 1 μM AF488-aS ve 1 μM Atto647N-Tau içeren) LLPS tamponunda karıştırıldığında, WF mikroskobunda görüldüğü gibi her iki proteini de içeren protein agregatlarını kolayca oluşturduklarını gözlemledik.(Şekil 2a).Damlacıklardaki iki proteinin kolokalizasyonu konfokal (CF) mikroskopi ile doğrulandı (Ek Şekil 1a).Bir toplama ajanı olarak dekstran-70 kullanıldığında da benzer davranış gözlendi (Ek Şekil 1c).FITC etiketli PEG veya dekstran kullanarak, her iki kalabalıklaştırıcı ajanın da numuneler arasında eşit şekilde dağıldığını, ne ayrışma ne de birleşme göstermediğini bulduk (Ek Şekil 1d).Daha ziyade, diğer LLP sistemlerinde33,34 görüldüğü gibi PEG tercihli olarak stabil bir kalabalıklaştırma ajanı olduğundan, bu sistemde makromoleküler kalabalıklaşma etkileri yoluyla faz ayrılmasını teşvik ettiklerini öne sürmektedir.Protein açısından zengin bu damlacıklar, NaCl'ye (1 M) duyarlıydı ancak 1,6-HD'ye (%10 v/v) duyarlı değildi, bu da elektrostatik özelliklerini doğruladı (Ek Şekil 2a, b).Sıvı davranışları, BF mikroskobu kullanılarak milisaniyelik birleşme damlacık olaylarının gözlemlenmesiyle doğrulandı (Şekil 2b).
αS/Tau441'in Konfokal (CF) mikroskopi görüntüleri LLPS tamponunda koaservatlardır (her proteinden 10 μM, 0,5 μM AF488 etiketli αS ve Atto647N etiketli Tau441).b αS/Tau441 damlacık füzyon olaylarının temsili diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntüleri (her protein için 10 μM).c 50 µM αS'nin yokluğunda (solda) veya varlığında (sağda) Tau441 LLPS'nin (0-15 µM) ışık saçılımına (350 nm'de) dayanan faz diyagramı.Daha sıcak renkler daha fazla saçılmayı gösterir.d Artan αS konsantrasyonuyla αS/Tau441 LLPS numunelerinin ışık saçılımı (5 µM'de Tau441, N = belirtildiği gibi 2–3 numune tekrarı).e Bu çalışmada kullanılan proteinin bazı tau proteini varyantlarının ve farklı bölgelerinin şematik gösterimi: negatif yüklü N-terminal alanı (kırmızı), prolin açısından zengin bölge (mavi), mikrotübül bağlama alanı (MTBD, turuncu renkle vurgulanmıştır) ve amiloid oluşturan çift sarmal.MTBD (gri) içinde yer alan filaman bölgeleri (PHF).Tau441'in Kalıntı Başına Net Ücret (NCPR) haritası gösterilmektedir.f 1 µM AF488 etiketli aS ve Atto647N etiketli ΔNt- kullanılarak, ΔNt-Tau (üst, protein başına 10 µM) veya K18 (alt, protein başına 50 µM) varlığında 1 µM AF488 etiketli αS veya ΔCt-αS kullanılarak )) ) LLPS veya K18 tamponunda yoğunlaştırılmış WF'nin mikrografları.Bir görüntüdeki ölçek çubukları, bir paneldeki tüm görüntülerin ölçeğini temsil eder (a, b ve f panelleri için 20 µm).Panel c ve d'ye ilişkin ham veriler, ham veri dosyaları olarak sağlanır.
Bu LLPS sürecinde aS'nin rolünü test etmek için, ilk önce artan NaCl konsantrasyonlarını kullanarak aS'nin damlacık stabilitesi üzerindeki etkisini nefelometri ile araştırdık (Şekil 2c).αS içeren numunelerdeki tuz konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, ışık saçılma değerleri de o kadar yüksek olur (350 nm'de), bu da αS'nin bu LLPS sistemindeki stabilize edici rolünü gösterir.Benzer bir etki, aS konsantrasyonunu (ve dolayısıyla aS:Tau441 oranını) yakl.Tau konsantrasyonuna (5 µM) göre 10 kat artış (Şekil 2d).αS'nin koaservatlarda bir iskele proteini olduğunu göstermek için, ΔNt-Tau adı verilen negatif yüklü bir N-terminal bölgesinden (kalıntılar 1-150, bakınız Şekil 2e) yoksun olan LLPS ile bozulmuş Tau mutantının davranışını araştırmaya karar verdik.WF mikroskobu ve nefelometri, ΔNt-Tau'nun kendisinin daha önce bildirildiği gibi LLPS'ye (Şekil 2f ve Ek Şekil 2d) maruz kalmadığını doğruladı 14. Bununla birlikte, bu kesik Tau varyantının dispersiyon çözeltilerine aS eklendiğinde, LLPS işlemi tamamen oldu benzer koşullar ve protein konsantrasyonları altında Tau ve aS'nin tam boyutlu çözeltilerinin damlacık yoğunluğuna yakın damlacık yoğunluğuyla restore edildi.Bu işlem aynı zamanda düşük makromoleküler kalabalıklaşma koşulları altında da gözlemlenebilir (Ek Şekil 2c).LLPS işleminde C-terminal aS bölgesinin (ancak tüm uzunluğunun değil) rolü, (ΔCt-'nin 104-140 (Şekil 1a) kalıntılarını içermeyen bir C-terminali kesik aS varyantı kullanılarak damlacık oluşumunun inhibisyonu ile gösterilmiştir. aS) proteini (Şekil 2f ve Ek Şekil 2d).αS ve ΔNt-Tau'nun kolokalizasyonu, konfokal floresan mikroskobu ile doğrulandı (Ek Şekil 1b).
Tau441 ve aS arasındaki LLPS mekanizmasını daha fazla test etmek için ek bir Tau varyantı, yani mikrotübül bağlama alanındaki (MTBD) eşleştirilmiş sarmal filaman çekirdek (PHF) fragmanı kullanıldı; eğer dört karakteristik tekrar alanı içeriyorsa, yaygın olarak da bilinir. K18 fragmanı olarak (bkz. Şekil 2e).Yakın zamanda aS'nin, mikrotübül bağlama alanından önce gelen bir dizide prolin bakımından zengin bir alanda bulunan bir tau proteinine tercihen bağlandığı rapor edilmiştir.Bununla birlikte, PHF bölgesi aynı zamanda pozitif yüklü kalıntılar (bkz. Şekil 2e), özellikle lizin (%15 kalıntı) açısından da zengindir; bu da bizi bu bölgenin aS/Tau kompleksinin yoğunlaşmasına katkıda bulunup bulunmadığını test etmeye sevk etti.Test edilen koşullar altında (%15 PEG veya %20 dekstran içeren LLPS tamponu) tek başına K18'in 100 μM'ye kadar konsantrasyonlarda LLPS'yi tetikleyemediğini gözlemledik (Şekil 2f).Bununla birlikte, 50 uM K18'e 50 uM aS eklediğimizde, nefelometri (Ek Şekil 2d) ve WF mikroskopisi (Şekil 2f) ile K18 ve aS içeren protein damlacıklarının hızlı oluşumu gözlendi.Beklendiği gibi, ΔCt-αS, K18'in LLPS davranışını geri getiremedi (Şekil 2f).αS/K18 toplanmasının, LLPS'yi tetiklemek için αS/ΔNt-Tau veya αS/Tau441'e kıyasla biraz daha yüksek protein konsantrasyonları gerektirdiğini, diğer şeylerin eşit olduğunu not ediyoruz.Bu, daha önce açıklandığı gibi31 mikrotübül bağlama alanına kıyasla aS C-terminal bölgesinin prolin açısından zengin Tau alanıyla daha güçlü bir etkileşimi ile tutarlıdır.
ΔNt-Tau'nun αS yokluğunda LLPS gerçekleştiremeyeceği göz önüne alındığında, tam uzunlukta Tau'ya (izotip, Tau441/Tau441) sahip LLPS sistemlerinde basitliği göz önüne alındığında, αS/Tau LLPS'yi karakterize etmek için bir model olarak bu Tau varyantını seçtik.karmaşık (heterotipik, αS/Tau441) toplama süreçleriyle.αS/Tau ve αS/ΔNt-Tau sistemlerinde αS toplanma derecesini (yoğunlaştırılmış faz proteininin bir parçası olarak, fαS,c) santrifüjleme ve dağınık faz SDS-PAGE analizi (bkz. 2e) ile karşılaştırdık, çok benzer değerler bulduk tüm proteinler için aynı konsantrasyonda.Özellikle, aS/Tau ve aS/ΔNt-Tau için sırasıyla fαS,c %84 ± %2 ve %79 ± %7 elde ettik; bu, aS ve tau arasındaki heterotipik etkileşimin, tau molekülleri arasındaki etkileşimden daha üstün olduğunu ortaya koymaktadır.arasında.
Çeşitli polikatyonlarla etkileşim ve yoğunlaşma işleminin aS kinetiği üzerindeki etkisi ilk olarak foto-ağartma (FRAP) yönteminden sonra floresans geri kazanımı ile incelenmiştir.αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ve αS/pLK koaservatlarını test ettik (2 μM αS AF488-αS ve 100 μM Tau441 veya ΔNt-Tau veya 1 mM pLK ile desteklenmiş 100 μM αS).Veriler, numune bileşenlerinin karıştırılmasından sonraki ilk 30 dakika içinde elde edildi.Temsili FRAP görüntülerinden (Şekil 3a, aS / Tau441 yoğunlaşması) ve bunlara karşılık gelen zaman süreci eğrilerinden (Şekil 3b, Ek Şekil 3), aS kinetiğinin Tau441 koaservatlarınınkine çok benzer olduğu görülebilir.ve pLK ile çok daha hızlı olan ΔNt-Tau.FRAP'a göre (Kang ve ark. 35 tarafından açıklandığı gibi) koaservat içindeki αS için hesaplanan difüzyon katsayıları, αS/Tau441 ve αS/ΔNt- için D = 0,013 ± 0,009 µm2/s ve D = 0,026 ± 0,008 µm2/s'dir. αS/ sistemi.pLK, Tau ve D = sırasıyla 0,18 ± 0,04 µm2/s (Şekil 3c).Bununla birlikte, dağılmış fazdaki difüzyon katsayısı aS, aynı koşullar altında (LLPS tamponu) ancak polikatyonların yokluğunda Floresans Korelasyon Spektroskopisi (FCS, bkz. Ek Şekil 3) ile belirlendiği gibi, tüm yoğunlaştırılmış fazlardan birkaç kat daha yüksektir. (D = 8 ± 4 µm2/s).Bu nedenle, aS çevirisinin kinetiği, belirgin moleküler kalabalıklaşma etkileri nedeniyle dağılmış fazdaki proteinlerle karşılaştırıldığında koaservatlarda önemli ölçüde azalır, ancak tüm koaservatlar, tau fazının aksine oluşumlarından sonraki ilk yarım saat boyunca sıvı benzeri özellikleri korur.pLK yoğunlaşmasında daha hızlı kinetik.
Elektrostatik koaservatlarda αS dinamiklerinin (%2 AF488 etiketli αS) a – c FRAP analizi.αS/Tau441 FRAP tahlillerinin üç kopya halinde temsili görüntüleri (a)'da gösterilmektedir; burada kırmızı daireler rengi giderilmiş alanları gösterir.Ölçek çubuğu 5 µm'dir.b Ortalama FRAP eğrileri ve (c) 100 µM αS ve Tau441 (kırmızı) veya ΔNt-Tau (mavi) veya pLK'nin (yeşil) eşmolar konsantrasyonları kullanılarak yapılan üç deneyden 5-6 (N) farklı damlacık için hesaplanan difüzyon katsayıları (D) LLPS konsantrasyonunun on katı.FRAP eğrisinin standart sapması gölgeli renkte gösterilmiştir.Karşılaştırma için, dağılmış fazdaki difüzyon katsayısı aS, floresans korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak üç kopya halinde belirlendi (daha fazla bilgi için bkz. Ek Şekil 3 ve yöntemler).d Herhangi bir polikatyon (siyah) olmadan veya 100 μM Tau441 (kırmızı) veya ΔNt-Tau (mavi) veya 1 mM pLK (yeşil) varlığında LLPS tamponunda 100 μM TEMPOL-122-αS'nin sürekli X-bant EPR spektrumları.Ek, en dramatik değişikliklerin meydana geldiği güçlü alan çizgilerinin büyütülmüş bir görünümünü göstermektedir.e LLPS yokluğunda (PEG yok) çeşitli polikatyonlarla 50 μM TEMPOL-122-aS'nin bağlanma eğrileri.Normalleştirilmiş EPR spektrumunun bant II (IIII/III) ile karşılaştırıldığında bant III'ün azaltılmış genliğinin, Tau441 (kırmızı), ΔNt-Tau (mavi) ve pLK'nin (yeşil) molar oranlarını arttırdığı gösterilmiştir.Renkli çizgiler, her eğride n adet aynı ve bağımsız bağlama bölgesine sahip kaba bir bağlama modeli kullanılarak verilere uygunluğu gösterir.Ham veriler ham veri dosyaları biçiminde sağlanır.
Tamamlayıcı olarak, yönlendirilmiş döndürme etiketleme (SDSL) ve sürekli elektron paramanyetik rezonansını (CW-EPR) kullanarak çeşitli koaservatlardaki aS dinamiklerini araştırdık.Bu yöntemin ÜİYOK'lerin esnekliğini ve dinamiklerini gerçekçi bir artık çözünürlükle rapor etmede çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır36,37,38.Bu amaçla tekli Cys mutantlarında sistein kalıntıları oluşturduk ve 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) spin probunu kullandık.Maleimid türevleri bunları etiketler.Daha spesifik olarak, TEMPOL problarını 122 veya 24 aS (TEMPOL-122-aS ve TEMPOL-24-aS) pozisyonuna yerleştirdik.İlk durumda, polikatyonlarla etkileşimde yer alan proteinin C-terminal bölgesini hedefliyoruz.Bunun yerine pozisyon 24 bize yoğunlaşan proteinlerin genel dinamikleri hakkında bilgi verebilir.Her iki durumda da dağılmış fazdaki proteinler için elde edilen EPR sinyalleri, hızlı hareket eden durumdaki nitroksit radikallerine karşılık geliyordu.Tau veya pLK (1:1 oranında 100 μM TEMPOL-aS, Tau441 veya ΔNt-Tau veya 1:10 oranında pLK) varlığında faz ayrılmasından sonra, göreceli tepe yoğunluğunda bir artış gözlendi. αS'nin EPR spektrumu.Kayıp çizgisi genişledi ve seyreltik fazdaki proteinle karşılaştırıldığında damlacıklarda aS yeniden yönlendirme kinetiğinin azaldığını gösterdi (Şekil 3d, Ek Şekil 4a).Bu değişiklikler 122. pozisyonda daha belirgindir. 24. pozisyonda pLK'nin varlığı probun kinetiğini etkilemezken, 122. pozisyonda spektral çizgi şekli önemli ölçüde değişti (Ek Şekil 4a).Spin etiketli IDP38,39'un dinamiklerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılan izotropik modeli (Ek Şekil 5a) kullanarak iki aS / polikatyon sisteminin 122. pozisyonundaki spektrumları modellemeye çalıştığımızda, deneysel spektrumları yeniden oluşturamadık..24 dönüş kontrastının konumunun spektral simülasyonu (Ek Şekil 5a).Bu, polikatyonların varlığında aS'nin C-terminal bölgesinin spin konfigürasyonları alanında tercihli pozisyonların olduğunu göstermektedir.Deneysel EPR koşulları altında yoğunlaştırılmış fazdaki αS fraksiyonu dikkate alındığında (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ve αS/pLK için sırasıyla %84 ± %2, %79 ± %7 ve %47 ± %4 - bkz. Ek Veri analizinin Şekil 2e c), EPR yöntemiyle tespit edilen genişlemenin esas olarak aS'nin C-terminal bölgesinin yoğunlaştırılmış fazdaki çeşitli polikatyonlarla etkileşimini yansıttığı görülebilir (TEMPOL-122- kullanılırken ana değişiklik) αS) ve protein yoğunlaşması değil.Probda mikroviskozitede bir artış gözlenir.Beklendiği gibi, LLPS dışındaki koşullar altında proteinin EPR spektrumu, karışıma 1 M NaCl eklendiğinde tamamen restore edildi (Ek Şekil 4b).Genel olarak verilerimiz, CW-EPR tarafından tespit edilen değişikliklerin esas olarak aS'nin C-terminal bölgesinin yoğunlaştırılmış fazdaki çeşitli polikatyonlarla etkileşimini yansıttığını ve bu etkileşimin pLK ile Tau'ya göre daha güçlü göründüğünü göstermektedir.
Koaservattaki proteinler hakkında daha fazla yapısal bilgi elde etmek için çözeltideki NMR'yi kullanarak LLPS sistemini incelemeye karar verdik.Bununla birlikte, yalnızca dağılmış fazda kalan αS fraksiyonunu tespit edebildik; bu, koaservat içindeki azalmış protein dinamiği ve NMR analizinde çözeltinin altındaki yoğun faz nedeniyle olabilir.LLPS numunesinin dağılmış fazında kalan proteinin yapısını ve dinamiklerini NMR (Ek Şekil 5c, d) kullanarak analiz ettiğimizde, proteinin pLK ve ΔNt-Tau varlığında neredeyse aynı şekilde davrandığını fark ettik. ikincil kimyasal kayma ve R1ρ gevşemesi üzerine yapılan deneylerle ortaya çıkarılan, protein omurgasının ikincil yapısında ve dinamiğinde bulunanlar.NMR verileri, aS'nin C terminalinin, polikatyonlarla etkileşimlerinden dolayı, protein dizisinin geri kalanı gibi düzensiz doğasını korurken, konformasyonel esneklikte önemli bir kayıp yaşadığını göstermektedir.
TEMPOL-122-aS yoğunlaştırılmış fazında gözlemlenen CW-EPR sinyal genişlemesi, proteinin polikatyonlarla etkileşimini yansıttığından, LLPS yokluğunda aS'nin çeşitli polikatyonlara bağlanma afinitesini değerlendirmek için bir EPR titrasyonu gerçekleştirdik (birikme yok) Tampon LLPS), etkileşimlerin seyreltik ve konsantre fazlarda aynı olduğunu öne sürer (bu, verilerimiz, Ek Şekil 4a ve Ek Şekil 6 ile doğrulanır).Amaç, ortak sıvı benzeri özelliklerine rağmen tüm koaservatların moleküler düzeyde herhangi bir temel diferansiyel davranış sergileyip sergilemediğini görmekti.Beklendiği gibi, EPR spektrumu artan polikatyon konsantrasyonuyla genişledi; bu, tüm etkileşim ortaklarının neredeyse doygunluğa kadar moleküler etkileşimleri nedeniyle moleküler esneklikte bir azalmayı yansıtıyordu (Şekil 3e, Ek Şekil 6).pLK bu doygunluğu ΔNt-Tau ve Tau441'e kıyasla daha düşük bir molar oranda (polikatyon:αS) elde etti.Aslında, verilerin n adet aynı ve bağımsız bağlanma bölgesini varsayan yaklaşık bir bağlanma modeliyle karşılaştırılması, pLK'nin (~5 μM) görünen ayrışma sabitinin, Tau441 veya ΔNt-Tau'nunkinden (~50 μM) daha düşük bir büyüklük sırası olduğunu gösterdi. ).uM).Bu kaba bir tahmin olmasına rağmen, aS'nin sürekli pozitif yük bölgelerine sahip daha basit polikatyonlara karşı daha yüksek bir afiniteye sahip olduğunu göstermektedir.αS ve çeşitli polikatyonlar arasındaki afinitedeki bu fark göz önüne alındığında, sıvı özelliklerinin zaman içinde farklı şekilde değişebileceğini ve dolayısıyla farklı LSPT süreçlerinden zarar görebileceğini varsaydık.
Protein koaservatı içindeki son derece kalabalık ortam ve proteinin amiloid yapısı göz önüne alındığında, olası LSPT süreçlerini saptamak için koaservatın zaman içindeki davranışını gözlemledik.BF ve CF mikroskobu kullanarak (Şekil 4), aS/Tau441'in çözelti içinde büyük ölçüde koaservasyona uğradığını, beklendiği gibi kuyunun/kaymanın alt kısmındaki yüzeye temas eden ve ıslatan büyük damlacıklar oluşturduğunu gözlemledik (Ek Şekil 4). .7d);dipten oluşan bu yapılara “protein salları” diyoruz.Bu yapılar, kaynaşma kabiliyetini korudukları için akışkan kaldı (Ek Şekil 7b) ve LLPS tetiklendikten birkaç saat sonra görülebildiler (Şekil 4 ve Ek Şekil 7c).Dengesiz yüklü elektrostatik koaservatlar ve dolayısıyla yüksek elektrostatik yüzey potansiyelleri için beklendiği gibi, ıslatma işleminin hidrofobik malzemelerden ziyade hidrofilik yüzeyinde tercih edildiğini gözlemledik (Ek Şekil 7a).Özellikle aS/ΔNt-Tau birleşimi ve rafting önemli ölçüde azalırken, aS/pLK yoğunlaşmaları önemli ölçüde azaldı (Şekil 4).Kısa inkübasyon süresi boyunca aS/pLK damlacıkları hidrofilik yüzeyi birleştirip ıslatabildi ancak bu süreç hızla durdu ve 5 saatlik inkübasyonun ardından yalnızca sınırlı birleşme olayları gözlendi ve herhangi bir ıslanma gözlemlenmedi.– jel damlama geçişi.
100 µM Tau441 (üst) floresans) mikroskobik görüntülerinin varlığında LLPS tamponunda 100 µM αS (%1 floresan etiketi) içeren koaservat örneklerinin temsili BF (gri tonlamalı paneller) ve CF (sağ paneller, AF488 etiketli yeşil αS) ΔNt -Tau (ortada) veya 1 mM pLK (altta) farklı kuluçka sürelerinde ve odak yüksekliklerinde (z, plaka kuyusunun tabanından mesafe).Deneyler birbirinden bağımsız olarak 4-6 kez tekrarlandı ve aynı sonuçlar elde edildi.αS/Tau441 koaservatları 24 saat sonra ıslanarak görüntüden daha büyük sallar oluşturur.Tüm görüntüler için ölçek çubuğu 20 µm'dir.
Daha sonra aS/Tau441 LLPS'de oluşan büyük sıvı benzeri protein havuzlarının incelenen proteinlerden herhangi birinin amiloid toplanmasına yol açıp açmayacağını sorduk.αS/Tau441 damlacıklarının zaman içinde olgunlaşmasını yukarıdakiyle aynı koşullar altında WF mikroskobu ile takip ettik, ancak 1 μM AF488 etiketli αS ve Atto647N etiketli Tau441 kullanarak takip ettik (Şekil 5a).Beklendiği gibi olgunlaşma süreci boyunca protein lokalizasyonunun tamamını gözlemledik.İlginç bir şekilde, ca.5 saat sonra salların içinde “nokta” dediğimiz, bir kısmı αS ile aynı yerde bulunan, bir kısmı da Tau441 açısından zenginleşen, daha yoğun dairesel olmayan yapılar gözlendi (Şekil 5a, beyaz oklar).Bu noktalar her zaman sallar içinde αS/ΔNt-Tau için αS/ΔNt-Tau'ya göre daha büyük ölçüde gözlemlenmiştir.Füzyon/ıslanma için yetersiz olan pLK ve Tau sistemlerinin damlacıklarında belirgin noktalar yoktu.αS ve Tau441 içeren bu lekelerin amiloid benzeri agregatlar olup olmadığını test etmek için, Tau441'in Atto647N ile etiketlendiği ve 12,5 μM amiloide özgü tioflavin-T'nin (ThT) baştan eklendiği CF mikroskopisini kullanarak benzer bir deney gerçekleştirdik.boya.Her ne kadar aS / Tau441 damlacıklarının veya sallarının ThT boyaması, 24 saatlik inkübasyondan sonra bile gözlenmese de (Şekil 5b, üst sıra - protein salları üzerinde kalan damlacıklar), salların içinde Atto647N-Tau441 içeren ThT pozitif yapılar çok zayıftı.bu, daha önce tarif edilen noktaların boyutunu, şeklini ve konumunu kopyalar (Şekil 5b, orta ve alt sıralar), bu da noktaların, yaşlanan sıvı koaservatlarında oluşan amiloid benzeri agregatlara karşılık gelebileceğini düşündürür.
LLPS tamponlu bir mikroskop plakası kuyusunda 25 μM Tau441 (1 μM AF488 etiketli αS ve Atto647N etiketli Tau441) varlığında çeşitli inkübasyon sürelerinde ve odak yüksekliklerinde (z, bağlı olmayan alttan mesafe) WF 25 μM αS) .Altı deney bağımsız olarak tekrarlandı ve benzer sonuçlar elde edildi.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N etiketli Tau441) ve 12,5 μM tioflavin-T (ThT) varlığında 25 μM αS'nin CF mikroskobik görüntüsü.Ağırlıklı protein damlacıkları ve biriken protein salları ve noktaları sırasıyla üst ve orta sıralarda gösterilmektedir.Alt satırda 3 bağımsız kopyadan sal ve düşme görüntüleri gösterilmektedir.Beyaz oklar her iki panelde de ThT pozitif noktaları gösterir.Tüm görüntüler için ölçek çubuğu 20 µm'dir.
Sıvıdan katıya geçiş sırasında koaservat protein ağındaki değişiklikleri daha ayrıntılı olarak incelemek için floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) ve Förster rezonans enerji transfer mikroskobu (FRET) kullandık (Şekil 6 ve Ek Şekil 8 ve 9).Katmanın koaservat olgunlaşmasının daha yoğunlaştırılmış veya hatta katı benzeri toplanmış bir protein yapısına dönüşmesinin, protein ile ona bağlı floresan prob arasında daha yakın temasa yol açtığını ve potansiyel olarak kısalmış prob ömründe (τ) ortaya çıkan bir söndürme etkisi ürettiğini varsaydık. , daha önce açıklandığı gibi40.,41 ,42.Ek olarak çift etiketli numuneler için (sırasıyla FRET donör ve alıcı boyalar olarak AF488 ve Atto647N), τ'deki bu azalmaya koaservat yoğunlaşması ve LSPT sırasında FRET(E) verimliliğindeki artış da eşlik edebilir.LLPS aS/Tau441 ve αS/ΔNt-Tau numunelerinde zaman içinde sal ve nokta oluşumunu izledik (αS etiketli 1 μM AF488 ve/veya Tau441 veya ΔNt-Tau etiketli Atto647N içeren LLPS tamponunda her proteinin 25 μM'si).AF488 (τ488) ve Atto647N (τ647N) problarının floresans ömrünün, koaservatlar olgunlaştıkça hafifçe azalması yönünde genel bir eğilim gözlemledik (Şekil 6 ve Ek Şekil 8c).İlginç bir şekilde, bu değişiklik sallar içindeki noktalar için önemli ölçüde arttırıldı (Şekil 6c), bu da noktalarda daha fazla protein yoğunlaşmasının meydana geldiğini gösterir.Bunu desteklemek için, 24 saat boyunca yaşlandırılan aS / ΔNt-Tau damlacıkları için floresans ömründe önemli bir değişiklik gözlenmedi (Ek Şekil 8d), bu, damlacık jelleşmesinin lekelenmeden farklı bir süreç olduğunu ve buna eşlik etmediğini gösterir. önemli moleküler yeniden düzenleme koaservatlar içinde.αS'de, özellikle aS/Tau441 sistemi için noktaların farklı boyutlara ve değişken içeriğe sahip olduğuna dikkat edilmelidir (Ek Şekil 8e).Spot floresan ömründeki azalmaya, özellikle Atto647N etiketli Tau441 (Ek Şekil 8a) için yoğunlukta bir artış ve hem aS / Tau441 hem de aS / ΔNt-Tau sistemleri için daha yüksek FRET verimlilikleri eşlik etti; bu, LLPS'de daha fazla yoğunlaşmayı gösterir Beş saat tetiklendikten sonra statik elektriğin içindeki proteinler yoğunlaştı.αS/ΔNt-Tau ile karşılaştırıldığında, αS/Tau441 noktalarında daha düşük τ647N ve biraz daha yüksek τ488 değerleri gözlemledik, buna daha düşük ve daha homojen olmayan FRET değerleri eşlik etti.Muhtemelen bu, aS / Tau441 sisteminde, agregalarda gözlemlenen ve beklenen aS bolluğunun Tau'ya kıyasla daha heterojen, genellikle substoikiometrik olması, çünkü Tau441'in kendisi de LLPS ve toplanmaya maruz kalabileceği gerçeğiyle ilişkili olabilir (Ek Şekil 8e) .Bununla birlikte, hem Tau441 hem de aS mevcut olduğunda damlacık birleşmesinin, sal oluşumunun ve daha da önemlisi sıvı benzeri koaservatlar içindeki protein toplanmasının derecesi maksimumdur.
LLPS tamponunda her proteinin 25 μM'sinde (1 μM AF488 etiketli αS ve 1 μM Atto647N etiketli Tau441 veya ΔNt-Tau) aS/Tau441 ve αS/ΔNt-Tau'nun ömür boyu floresan mikroskobu (FLIM) görüntüleri.Sütunlar, farklı olgunlaşma sürelerinde (30 dakika, 5 saat ve 24 saat) LLPS numunelerinin temsili görüntülerini gösterir.Kırmızı çerçeve, αS/Tau441 noktalarını içeren bölgeyi gösterir.Yaşam süreleri renkli çubuklar halinde gösterilir.Ölçek çubuğu = tüm görüntüler için 20 µm.b Panel a'daki kırmızı kutuda gösterilen, seçilen alanın yakınlaştırılmış FLIM görüntüsü.Yaşam aralıkları panel a'dakiyle aynı renk skalası kullanılarak gösterilir.Ölçek çubuğu = 5 µm.c αS- için kaydedilen FLIM görüntülerinde tanımlanan farklı protein türleri (damlacıklar-D-, sal-R- ve benek-P) için AF488'i (αS'ye bağlı) veya Atto647N'yi (Tau'ya bağlı) gösteren histogramlar, Tau441'in zamanlama dağılımları ömrü ve αS/ΔNt-Tau koaservat örnekleri (D için N = 17-32 ROI, R için 29-44 ROI ve noktalar için 21-51 ROI).Ortalama ve medyan değerler kutuların içinde sırasıyla sarı kareler ve siyah çizgilerle gösterilmiştir.Kutunun alt ve üst sınırları sırasıyla birinci ve üçüncü çeyrekleri temsil eder ve 1,5 kat çeyrekler arası aralık (IQR) içindeki minimum ve maksimum değerler bıyık olarak gösterilir.Aykırı değerler siyah elmas olarak gösterilir.Dağılım çiftleri arasındaki istatistiksel anlamlılık, varyansların eşit olmadığı varsayılarak iki örnekli bir t testi kullanılarak belirlendi.İki kuyruklu t-testi p değerleri, karşılaştırılan her veri çifti için yıldız işaretleriyle gösterilir (* p-değeri > 0,01, ** p-değeri > 0,001, *** p-değeri > 0,0001, **** p-değeri > 0,00001), ns İhmal edilebilirliği gösterir (p-değeri > 0,05).Kesin p değerleri Ek Tablo 1'de verilmiştir ve orijinal veriler ham veri dosyaları olarak sunulmuştur.
Beneklerin/agregatların amiloid benzeri doğasını daha da göstermek için, boyanmamış koaservat numunelerini 24 saat boyunca yüksek konsantrasyonlarda (1 M) NaCl ile işleme tabi tuttuk; bu, agregatların protein koaservatlardan ayrılmasıyla sonuçlandı.Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak izole edilmiş agregatlar (yani agregatların dağılmış bir çözeltisi) gözlemlendiğinde, yaklaşık 15 nm'lik düzenli bir yüksekliğe sahip, ağırlıklı olarak küresel bir morfoloji gözlemledik; bu, benzer şekilde yüksek tuz konsantrasyonu koşulları altında birleşme eğilimi gösterir. yüzey üzerindeki güçlü hidrofobik etkiye bağlı olarak tipik amiloid fibrillerin davranışı (fibrillerin tipik olarak ~ 10 nm yüksekliğe sahip olduğuna dikkat edin) (Ek Şekil 10a).İlginç bir şekilde, izole edilmiş agregatlar standart bir ThT floresans tahlilinde ThT ile inkübe edildiğinde, ThT floresans kuantum veriminde, boyanın tipik aS amiloid fibrilleri (Ek Şekil 10b) ile inkübe edildiğinde gözlemlenenle karşılaştırılabilir dramatik bir artış gözlemledik. koaservat agregatları amiloid benzeri yapılar içerir..Aslında, agregatlar yüksek tuz konsantrasyonlarına toleranslıydı ancak tipik amiloid fibriller gibi 4 M guanidin klorüre (GdnHCl) duyarlıydı (Ek Şekil 10c).
Daha sonra, tek moleküllü floresans, spesifik floresans korelasyonu/çapraz korelasyon spektroskopisi (FCS/FCCS) ve iki renkli tesadüf tespitinin (TCCD) patlama analizini kullanarak agregatların bileşimini analiz ettik.Bu amaçla, 1 μM AF488 etiketli aS ve 1 μM Atto647N etiketli Tau441 ile birlikte aS ve Tau441 (her ikisi de 25 μM) içeren 100 ul LLPS numunelerinde 24 saatlik inkübasyonun ardından oluşan agregatları izole ettik.LLPS ve protein arasındaki olası elektrostatik etkileşimleri önlemek için aynı PEG içermeyen tamponu ve 1 M NaCl'yi (agregaları koaservattan ayırmak için kullanılan aynı tampon) kullanarak elde edilen dağılmış agrega çözeltisini monomoleküler bir duruma seyreltin.Tek bir molekülün zaman yörüngesinin bir örneği Şekil 7a'da görülebilir.FCCS/FCS analizi (çapraz korelasyon, CC ve otokorelasyon, AC), örneklerde aS ve tau içeren agregatların bol olduğunu gösterdi (Şekil 7b'deki CC eğrisine bakın, sol panel) ve kalıntı monomerik protein fazlasının ortaya çıktığını gösterdi. seyreltme işleminin sonucu (bkz. Şekil 7b, sol paneldeki AC eğrileri).Yalnızca monomerik proteinler içeren numuneler kullanılarak aynı çözelti koşulları altında gerçekleştirilen kontrol deneyleri hiçbir CC eğrisi göstermedi ve AC eğrileri, monomerik proteinlerin beklenen difüzyon katsayılarına sahip olduğu tek bileşenli difüzyon modeline (Denklem 4) iyi uyuyor (Şekil 7b). ), sağ panel).Toplanmış parçacıkların difüzyon katsayısı 1 µm2/s'den azdır ve monomerik proteinlerin difüzyon katsayısı yaklaşık 1 µm2/s'dir.50–100 µm/sn;değerler, sonikasyona tabi tutulmuş aS amiloid fibrilleri ve benzer çözüm koşulları altında ayrı ayrı monomerik aS için daha önce yayınlanmış değerlere benzerdir44.Agregatları TCCD patlama analiziyle analiz ettiğimizde (Şekil 7c, üst panel), izole edilmiş her agregatta (aS/Tau heteroagregatı), tespit edilen agregatların yaklaşık %60'ının hem aS hem de tau içerdiğini, yaklaşık %30'unun ise yalnızca içerdiğini bulduk. tau, yalnızca yaklaşık %10 αS.αS/Tau heteroagregatlarının stokiyometrik analizi, heteroagregatların çoğunun tau bakımından zengin olduğunu gösterdi (stoikiometri 0,5'in altında, agrega başına ortalama tau molekülü sayısı aS moleküllerinden 4 kat daha fazladır), bu da FLIM'de yerinde gözlemlenen çalışmamızla tutarlıdır. deneyler..FRET analizi, bu agregatların her iki proteini de içerdiğini gösterdi, ancak bu durumda gerçek FRET değerleri çok önemli değil çünkü her agregattaki floroforların dağılımı, deneyde kullanılan etiketsiz proteinin fazlalığı nedeniyle rastgele oldu.İlginç bir şekilde, aynı analizi 45,46 olgun amiloid toplanması yetersiz Tau varyantını kullanarak yaptığımızda (bkz. Ek Şekil 11a,b), aS elektrostatik toplanmasının aynı olmasına rağmen (Ek Şekil 11c, d), koaservat içinde agregat oluşturma yeteneği büyük ölçüde azaldı ve FLIM, yerinde deneylerde birkaç nokta tespit etti ve izole edilmiş agrega numuneleri için zayıf çapraz korelasyon eğrileri gözlemlendi.Bununla birlikte, tespit edilen agregatların az bir kısmı için (Tau441'in yalnızca onda biri), her agregatın bu Tau varyantına göre aS açısından zenginleştiğini, tespit edilen agregatların yaklaşık %50'sinin yalnızca aS molekülleri içerdiğini ve aS'nin aşırı derecede heterojen olduğunu gözlemledik. .Tau441 tarafından üretilen heterojen agregatların aksine agregatlar (bakınız Ek Şekil 11e) (Şekil 6f).Bu deneylerin sonuçları, aS'nin kendisinin koaservat içinde tau ile birikme yeteneğine sahip olmasına rağmen, tau çekirdeklenmesinin bu koşullar altında daha uygun olduğunu ve ortaya çıkan amiloid benzeri agregatların, aS ve tau'nun bir formu olarak hareket edebildiğini gösterdi.Bununla birlikte, tau açısından zengin bir çekirdek oluştuğunda, aS ve tau arasındaki heterotipik etkileşimler, tau molekülleri arasındaki homotipik etkileşimlere göre agregatlarda tercih edilir;ayrıca sıvı aS/tau koaservatlarındaki protein ağlarını da gözlemliyoruz.
aS / Tau441 elektrostatik koaservatlarda oluşturulan izole edilmiş agregatların tek moleküllerinin temsili bir floresans zamansal izleri.αS/Tau441 koagregatlarına karşılık gelen patlamalar (belirtilen eşiğin üzerindeki patlamalar) üç tespit kanalında gözlemlendi (doğrudan uyarımdan sonra AF488 ve Atto647N emisyonu, mavi ve kırmızı çizgiler, dolaylı uyarmadan sonra Atto647N emisyonu), FRET, mor çizgi).b LLPS'den (sol panel) elde edilen izole edilmiş aS/Tau441 agregatlarının bir örneğinin FCS/FCCS analizi.AF488 ve Atto647N için otokorelasyon (AC) eğrileri sırasıyla mavi ve kırmızı renkte gösterilir ve her iki boyayı içeren agregatlarla ilişkili çapraz korelasyon (CC) eğrileri mor renkte gösterilir.AC eğrileri, etiketli monomerik ve toplanmış protein türlerinin varlığını yansıtırken, CC eğrileri yalnızca çift etiketli agregatların difüzyonunu gösterir.Aynı analiz, ancak izole edilmiş noktalardakiyle aynı çözüm koşulları altında, yalnızca monomerik aS ve Tau441 içeren numuneler sağ panelde kontroller olarak gösterilir.c aS/Tau441 elektrostatik koaservatlarda oluşturulan izole edilmiş agregatların tek moleküllerinin floresans flaş analizi.Dört farklı tekrarda (N = 152) bulunan her bir agrega için bilgi stokiyometriye, S değerlerine ve FRET verimliliğine (üst panel, renk çubuğu oluşumu yansıtır) göre çizilir.Üç tür agrega ayırt edilebilir: S~1 ve FRET~0'a sahip yalnızca αS agregatları, S~0 ve FRET~1'e sahip yalnızca Tau agregatları ve ara S ve FRET'e sahip heterojen Tau/αS agregatları Miktar tahminleri Her bir heterojen agregatta (N = 100) tespit edilen her iki işaretleyici proteinin her ikisi de alt panelde gösterilir (renk skalası, oluşumu yansıtır).Ham veriler ham veri dosyaları biçiminde sağlanır.
Sıvı protein yoğunlaşmalarının zamanla jel benzeri veya katı yapılar halinde olgunlaşması veya yaşlanmasının, amiloid toplanmasından önceki anormal bir süreç olarak hastalığın yanı sıra yoğunlaşmanın çeşitli fizyolojik fonksiyonlarında47 rol oynadığı rapor edilmiştir 7, 48, 49. Burada Faz ayrımını ve davranışı ayrıntılı olarak inceliyoruz.Düşük mikromolar konsantrasyonlarda ve fizyolojik olarak ilgili koşullarda kontrollü bir ortamda rastgele polikatyonların varlığında LSPT aS (αS'nin hesaplanan fizyolojik konsantrasyonunun >1 μM50 olduğunu unutmayın), LPS'nin tipik termodinamik olarak yönlendirilen davranışını takiben.Fizyolojik pH'ta oldukça negatif yüklü bir C-terminal bölgesi içeren aS'nin, elektrostatik işlem yoluyla pLK veya Tau gibi yüksek derecede katyonik düzensiz peptidlerin varlığında LLPS yoluyla sulu çözeltide protein açısından zengin damlacıklar oluşturabildiğini bulduk. toplanma makromoleküllerinin varlığında karmaşık yoğunlaşma.Bu süreç, aS'nin hem in vitro hem de in vivo hastalıkla ilişkili toplanmasıyla ilişkili çeşitli polikatyonik moleküllerle karşılaştığı hücresel ortamda ilgili etkilere sahip olabilir51,52,53,54.
Birçok çalışmada damlacıklar içindeki protein dinamikleri olgunlaşma sürecini belirleyen temel faktörlerden biri olarak kabul edilmiştir55,56.Elektrostatik αS'de polikatyonlarla koaservatlarda olgunlaşma süreci görünüşe göre polikatyonlarla etkileşimlerin gücüne, valansına ve bu etkileşimlerin çokluğuna bağlıdır.Denge teorisi, iki sıvı durumdan oluşan bir denge manzarasının, LLPS57,58'i harekete geçiren biyopolimerler açısından zengin büyük bir damlacığın varlığı olacağını öne sürüyor.Damlacık büyümesi, Ostwald olgunlaşması59, birleşme60 veya dağılmış fazda61 serbest monomerin tüketilmesiyle sağlanabilir.αS ve Tau441, ΔNt-Tau veya pLK için proteinin çoğu, bu çalışmada kullanılan koşullar altında yoğunlaşmıştır.Bununla birlikte, tam boyutlu tau damlacıkları yüzey ıslanması üzerine hızla birleşirken, damlacık birleşmesi ve ıslanması ΔNt-Tau ve pLK için zordu, bu da bu iki sistemde sıvı özelliklerinin hızlı bir şekilde kaybolduğunu gösteriyor.FLIM-FRET analizimize göre, yaşlandırılmış pLK ve ΔNt-Tau damlacıkları, orijinal damlacıklarla benzer derecede protein toplanması (benzer floresans ömrü) gösterdi; bu, daha katı da olsa orijinal protein ağının korunduğunu gösteriyor.
Deneysel sonuçlarımızı aşağıdaki modelde rasyonelleştiriyoruz (Şekil 8).Başlangıçta geçici olarak oluşan damlacıklar genellikle elektrostatik dengelemesi olmayan protein ağlarıdır ve bu nedenle, özellikle damlacık arayüzünde yüksek elektrostatik yüzey potansiyeline sahip damlacıklarla sonuçlanan yük dengesizliği alanları vardır.Yükü telafi etmek (genellikle değerlik tükenmesi olarak adlandırılan bir olay) ve damlacıkların yüzey potansiyelini en aza indirmek için damlacıklar, seyreltik fazdan yeni polipeptitler içerebilir, yük-yük etkileşimlerini optimize etmek için protein ağlarını yeniden düzenleyebilir ve diğer damlacıklarla etkileşime girebilir.yüzeylerle (ıslatma).αS/pLK damlacıkları, daha basit protein ağları (yalnızca αS ve pLK arasındaki heterotipik etkileşimler) ve protein-protein etkileşimlerine daha fazla ilgi duymaları nedeniyle, kondensat yükünü daha hızlı dengeleyebiliyor gibi görünüyor;aslında, başlangıçta oluşan aS/pLK koaservatlarında aS/Tau'ya göre daha hızlı protein kinetiği gözlemledik.Değerlik tükenmesinden sonra, etkileşimler daha az geçici hale gelir ve damlacıklar sıvı özelliklerini kaybeder ve düşük elektrostatik yüzey potansiyeline sahip (ve dolayısıyla yüzeyi ıslatamayan) jel benzeri, yanıcı olmayan damlacıklara dönüşür.Buna karşılık, αS/Tau damlacıkları, daha karmaşık protein ağları (hem homotipik hem de heterotipik etkileşimlerle birlikte) ve protein etkileşimlerinin daha zayıf doğası nedeniyle damlacık yük dengesini optimize etmede daha az verimlidir.Bu, uzun süreler boyunca sıvı davranışını koruyan ve birleşme ve büyüme (böylece damlacıkların yüzey alanı/hacim oranı en aza indirilir) ve hidrofilik yüzey kimyasalının ıslatılmasıyla en aza indirilme eğiliminde olan yüksek bir elektrostatik yüzey potansiyeli sergileyen damlacıklarla sonuçlanır.Bu, protein ağındaki sürekli yük optimizasyonu arayışı nedeniyle etkileşimler çok geçici kaldığından, akışkan özelliklerini koruyan büyük konsantre protein kitaplıkları oluşturur.İlginç bir şekilde, bazı doğal olarak oluşan izoformlar62 dahil olmak üzere Tau'nun N-terminal olarak kesilmiş formları, bazı koaservatların aS ile yaşlanarak uzun ömürlü jel benzeri damlacıklara dönüştüğü, diğerlerinin ise büyük sıvı yoğunlaşmalarına dönüştüğü ara davranış sergiler.αS elektrostatik koaservatların olgunlaşmasındaki bu ikilik, yoğuşma boyutunu ve akışkan özelliklerini kontrol etmenin anahtarı olarak yoğuşma maddelerinde değerlik tükenmesi ile elektrostatik eleme arasında bir korelasyon tanımlayan son LLPS teorik ve deneysel çalışmalarıyla tutarlıdır.Mekanizma 58.61.
Bu şema, LLPS ve LSPT yoluyla aS ve Tau441 için varsayılan amiloid toplanma yolunu gösterir.Ek anyon açısından zengin (kırmızı) ve katyon açısından zengin (mavi) bölgelerle, tatmin edici değerliğe sahip aS ve tau elektrostatik koaservatlar daha düşük yüzey enerjisine ve dolayısıyla daha az birleşmeye sahiptir, bu da damlacık yaşlanmasının hızlı olmasına neden olur.Stabil, topaklaşmamış bir jel durumuna ulaşılır..Bu durum, hızlı jel benzeri bir geçişe izin veren daha yüksek afinitesi ve daha basit protein çifti etkileşim ağı nedeniyle aS/pLK sistemi durumunda çok uygundur.Tam tersine, yetersiz valansa sahip damlacıklar ve dolayısıyla etkileşim için uygun protein yüklü bölgeler, koaservatın yüksek yüzey enerjisini azaltmak için hidrofilik yüzeyi kaynaşmasını ve ıslatmasını kolaylaştırır.Bu durum, zayıf Tau-Tau ve aS-Tau etkileşimlerinden oluşan çok değerlikli karmaşık bir ağa sahip olan αS/Tau441 koaservatları için tercih edilir.Buna karşılık, daha büyük koaservatlar sıvı benzeri özelliklerini daha kolay koruyacak ve diğer protein-protein etkileşimlerinin oluşmasına izin verecektir.Sonunda, koaservat sıvısı içinde hem aS hem de tau içeren amiloid heterojen agregatlar, nörodejeneratif hastalıkların ayırt edici özellikleri olan inklüzyon cisimciklerinde bulunanlarla ilişkili olabilir.
αS/Tau441'in oldukça sıkışık ancak dinamik bir protein ortamıyla olgunlaşması sırasında oluşan büyük sıvı benzeri yapılar ve daha az ölçüde aS/ΔNt-Tau koaservatları, protein toplanmasının çekirdeklenmesi için ideal rezervuarlardır.Genellikle hem aS hem de tau içeren bu tip protein koaservatlarında katı protein agregatlarının oluşumunu gerçekten gözlemledik.Bu heteroagregatların elektrostatik olmayan etkileşimlerle stabilize edildiğini, amiloide özgü ThT boyalarını tipik amiloid fibrilleriyle aynı şekilde bağlayabildiklerini ve aslında çeşitli etkilere karşı benzer dirence sahip olduklarını gösterdik.LLPS tarafından oluşturulan aS/tau agregatlarının amiloid benzeri özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir.Aslında, amiloid agregasyonunda eksik olan olgun Tau varyantı, sıvı elektrostatik koaservat içinde bu heterojen aS agregatlarının oluşumunda önemli ölçüde bozulmuştur.aS/Tau441 agregatlarının oluşumu yalnızca sıvı benzeri özellikleri koruyan koaservatların içinde gözlendi ve koaservatlar/damlacıklar jel durumuna ulaşmadıysa hiçbir zaman gözlemlenmedi.İkinci durumda, elektrostatik etkileşimlerin artan gücü ve bunun sonucunda protein ağının sertliği, amiloid çekirdeklenmesi için gerekli yeni protein etkileşimlerini oluşturmak üzere proteinlerin gerekli konformasyonel yeniden düzenlemelerini engeller.Ancak bu, boyutları arttıkça sıvı kalma olasılığı daha yüksek olan daha esnek, sıvı benzeri koaservatlarda başarılabilir.
Yoğunlaştırılmış faz içinde agregat oluşumunun, hızla jelleşen küçük damlacıklara göre büyük aS/Tau yoğunlaşmalarında tercih edilmesi, damlacık birleşmesini kontrol eden faktörlerin belirlenmesinin önemini vurgulamaktadır.Bu nedenle, yalnızca faz ayrımı eğilimi mevcut değildir, aynı zamanda hastalığın önlenmesinin yanı sıra düzgün işleyiş için kondensin boyutunun da kontrol edilmesi gerekir58,61.Sonuçlarımız aynı zamanda αS/Tau sistemi için LLPS ve LSPT arasındaki dengenin önemini de vurgulamaktadır.Damlacık oluşumu, diğer sistemlerde63,64 önerildiği gibi, doyma koşulları altında mevcut olan protein monomerlerinin miktarını azaltarak amiloid toplanmasına karşı koruma sağlayabilirken, yüksek damlacık seviyelerinde damlacık füzyonu, yavaş konformasyonel yeniden düzenlemeler yoluyla dahili protein toplanmasına yol açabilir.protein ağları..
Genel olarak verilerimiz, LSPT bağlamında bırakma ağlarındaki uyumlu değerliğin ve tatmin edici/tatminsiz etkileşimlerin uygunluğunu güçlü bir şekilde vurgulamaktadır.Özellikle, tam uzunluktaki aS/Tau441 yoğunlaşmalarının, her iki proteini de içeren amiloid benzeri heteroagregatlar oluşturmak için verimli bir şekilde kaynaşabildiğini ve çekirdekleşebildiğini gösteriyoruz ve deneysel sonuçlarımıza dayalı bir moleküler mekanizma öneriyoruz.Burada rapor ettiğimiz aS/Tau sıvısı koaservatındaki iki proteinin birlikte toplanması, aslında hastalığın ayırt edici özellikleri olan iki proteinin kapanımlarda birlikte lokalizasyonu ile ilişkili olabilir ve LLPS ile LLPS arasındaki ilişkinin anlaşılmasına katkıda bulunabilir. amiloid toplanması, nörodejenerasyonda yüksek oranda yüklü IDP'nin önünü açıyor.
Monomerik WT-aS, sistein mutantları (Q24C-aS, N122C-aS) ve ΔCt-aS varyantları (Δ101-140), E. coli'de eksprese edildi ve daha önce açıklandığı gibi saflaştırıldı.Disülfür bağı oluşumunu önlemek için aS sistein mutantlarının saflaştırılmasındaki tüm adımlara 5 mM DTT dahil edildi.Tau441 izoformu (Addgene #16316'dan elde edilen plazmit), ΔNt-Tau varyantı (Δ1–150, IVA'nın CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC primerleri ile klonlanmasıyla elde edildi) ve AggDef-Tau varyantı (Δ275–311, GGCTC5 primeri ile saflaştırılmış) E. coli kültürleri 37°C'de ve 180 rpm'de OD600 = 0,6-0,7'ye büyütüldü ve ekspresyon, 37°C'de 3 saat boyunca IPTG ile indüklendi.Hücreleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 11.500 xg'de hasat edin ve 150 mM NaCl içeren tuzlu su tamponuyla yıkayın.Lizis tamponunda pelleti yeniden süspanse edin (1 L LB başına 20 ml: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 μM, kopeptin 100 μM).Sonikasyon adımı buz üzerinde 10 darbe için %80 genlik ile (1 dakika açık, 1 dakika kapalı) gerçekleştirildi.Bir ultrasonda 60 ml'yi aşmayın.E. coli lizatları 95°C'de 20 dakika süreyle ısıtıldı, daha sonra buz üzerinde soğutuldu ve 127.000 xg'de 40 dakika süreyle santrifüjlendi.Berraklaştırılmış süpernatan, 3,5 kDa'lık bir membrana (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, İngiltere) uygulandı ve 4 L diyaliz tamponuna (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) karşı diyalize edildi. , PMSF 0,1 mM) 10 saat boyunca.5 ml'lik bir katyon değiştirme kolonu (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ABD), dengeleme tamponu (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ile dengelendi.Tau lizatı, 0,22 μm'lik bir PVDF filtreden filtrelendi ve 1 ml/dakika akış hızında kolona enjekte edildi.Elüsyon kademeli olarak gerçekleştirildi, tau %15-30 elüsyon tamponu (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) ile elüte edildi.Fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edildi ve beklenen tau molekül ağırlığına sahip bir bant içeren fraksiyonlar, 10 kDa'lık bir santrifüj filtresi kullanılarak konsantre edildi ve 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ve DTT 2 mM içeren bir tamponla değiştirildi. nihai protein konsantrasyonu 100 uM idi.Protein çözeltisi daha sonra 0,22 um'lik bir PVDF filtreden geçirildi, hızla donduruldu ve -80°C'de saklandı.Protein K18, Prof. Alberto Boffi tarafından sağlanmıştır.Preparatın saflığı, SDS-PAGE ve MALDI-TOF/TOF ile doğrulandığı gibi >%95 idi.Çeşitli sisteinler, AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABD) veya TEMPOL-maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada) ile kimyasal olarak etiketlendi.absorbans ve MALDI-TOF/TOF ile doğrulandı.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ve K18, aynı prosedür izlenerek Atto647N-maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Almanya) kullanılarak 191 ve 322 pozisyonlarındaki doğal sistein kalıntılarıyla etiketlendi.aS ve Tau441 için kalıntı başına net yük haritaları CIDER66 kullanılarak üretildi.
Katı poli-L-lizin (tedarikçiden NMR'ye göre pLK DP 90-110, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, ABD), 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 ila 10 mM konsantrasyonda çözüldü, işlem 5 dakika sonikasyona tabi tutuldu dakika ultrasonik su banyosunda bekletin ve -20°C'de saklayın.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ABD) ve FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, ABD) suda çözünür ve LLPS tamponunda geniş çapta dağıtılır.Diyaliz kirletici tuzları uzaklaştırır.Daha sonra gözenek büyüklüğü 0,22 µm olan bir şırınga filtresinden filtrelendiler ve konsantrasyonları bir refraktometre (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, ABD) kullanılarak hesaplandı.LLPS numuneleri oda sıcaklığında aşağıdaki sırayla hazırlandı: tampon ve ekstrüzyon karıştırıldı ve 1 mM tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etan- 1,2-diildinitril) tetraasetik asit (EDTA, karboksint) ve %1 proteaz inhibitörünün (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM) bir karışımı.Daha sonra aS ve kaynaşmış polikatyonlar (pLK veya Tau seçenekleri) eklenir.Thioflavin-T zaman serisi deneyleri için (ThT, Carbosynth, Compton, UK), toplam ThT konsantrasyonunu αS konsantrasyonunun yarısı olacak şekilde kullanın.Homojen olduklarından emin olmak için numuneleri yavaşça ama iyice karıştırın.Her bileşenin konsantrasyonu, Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi deneyden deneye değişiklik gösterdi.Azid, deney süresi 4 saati aştığında %0,02 (ağırlık/hacim) konsantrasyonunda kullanıldı.LLPS örneklerinin kullanıldığı tüm analizler için, karışımın analizden önce 5 dakika dengelenmesine izin verin.Işık saçılımı analizi için, 150 ul numune bağlayıcı olmayan 96 oyuklu mikroplakalara (μClear®, siyah, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Avusturya) yüklendi ve yapışkan filmle kaplandı.LLP'ler, bir CLARIOstar plaka okuyucusunda (BMG Labtech, Ortenberg, Almanya) çözeltinin merkezinde 350 nm'de absorbans ölçülerek izlendi.Deneyler 25°C'de üç kopya halinde gerçekleştirildi ve hatalar, ortalamadan standart sapma olarak hesaplandı.Seyreltik faz, numune santrifüjleme ve SDS-PAGE jel analizi ile ölçüldü ve seyreltik ve konsantre fazlardaki aS fraksiyonu, çeşitli LLPS çözeltilerinde ölçüldü.1 μM AF488 etiketli aS içeren 100 ul'lik bir LLPS örneği, iyice karıştırılarak ve ardından 30 dakika boyunca 9600 x g'de santrifüjleme yoluyla hazırlandı; ardından çökelti genellikle görünür hale geldi.Süpernatanın üst 50 ul'si, SDS-PAGE jeli kullanılarak protein ölçümü için kullanıldı.Jeller, bir ChemiDoc jel görüntüleme sistemi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABD) kullanılarak AF488 filtreleri ile tarandı veya Coomassie boyası ile boyandı ve uygun filtrelerle görselleştirildi.Ortaya çıkan bantlar ImageJ versiyon 1.53i (Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD) kullanılarak analiz edildi.Deneyler, benzer sonuçlara sahip iki farklı deneyde iki kopya halinde gerçekleştirildi.
Tipik olarak, bağlayıcı olmayan 96 oyuklu mikroplakalara 150 ul numune uygulandı ve oda sıcaklığında bir Leica DMI6000B ters mikroskopta (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) görüntülendi.Nokta deneyleri için µ-Slide Anjiyogenez plakaları (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almanya) veya 96 oyuklu polistiren mikroplakalar (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) de kullanıldı.Aydınlatma kaynağı olarak EL6000 halojen veya cıva metal halojenür lambalar kullanıldı (sırasıyla BF/DIC ve WF görüntüleme için).WF mikroskobu için, ışığı numuneye odaklamak ve toplamak üzere 40x büyütmeli bir hava hedefi (Leica Microsystems, Almanya) kullanıldı.AF488 ve ThT etiketli numuneler için, standart GFP filtre setleri, uyarma ve emisyon bant geçiren filtreler, sırasıyla 460–500 nm ve 512–542 nm bant geçiren filtreler ve 495 nm dikroik ayna ile uyarma ve emisyonu filtreleyin.Atto647N ile etiketlenmiş numuneler için, sırasıyla 628-40 nm ve 692-40 nm uyarma ve emisyon bant geçiren filtrelere sahip standart bir Cy5 filtre seti ve 660 nm dikroik ayna kullanıldı.BF ve DIC mikroskobu için aynı yansıyan ışık toplama hedefini kullanın.Toplanan ışık bir Leica DFC7000 CCD kameraya (Leica Microsystems, Almanya) kaydedildi.Maruz kalma süresi BF ve DIC mikroskobu görüntüleme için 50 ms ve WF mikroskopi görüntüleme için 20-100 ms idi.Karşılaştırma amacıyla, ThT ile yapılan tüm deneylerin maruz kalma süresi 100 ms idi.Damlacık birleşmesini görselleştirmek için hızlandırılmış deneyler yapıldı; görüntüler birkaç dakika boyunca her 100 ms'de bir toplandı.Görüntü analizi için ImageJ (NIH, ABD) kullanıldı.Deneyler benzer sonuçlarla üç kopya halinde gerçekleştirildi.
Kolokalizasyon deneyleri, FRAP ve 3D yeniden yapılandırma için görüntüler, ZEN 2 mavi baskısı (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almanya) kullanılarak Zeiss LSM 880 ters konfokal mikroskopta elde edildi.50 ul'lik numuneler µ-Slide Anjiyogenez Petri kaplarına (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Almanya) uygulandı, hidrofilik bir polimer (ibiTreat) ile işlendi ve 63x yağa batırılmış objektife (Plan-Apochromat 63x/NA 1.4 Oil) monte edildi. DIC'de).Görüntüler, 470–600 nm, 493–628 nm'lik uyarma ve emisyon algılama pencereleri için 0,26 µm/piksel çözünürlüğe ve 8 µs/piksel maruz kalma süresine sahip 458 nm, 488 nm ve 633 nm argon lazer çizgileri kullanılarak elde edildi. ve sırasıyla ThT, AF488 ve Atto647N'yi görselleştirmek için 638-755 nm kullanıldı.FRAP deneyleri için her numunenin hızlandırılmış fotoğrafı saniyede 1 kare hızında kaydedildi.Deneyler benzer sonuçlarla oda sıcaklığında üç kopya halinde gerçekleştirildi.Tüm görüntüler Zen 2 blue edition yazılımı (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almanya) kullanılarak analiz edildi.FRAP eğrileri normalleştirildi, çizildi ve OriginPro 9.1 kullanılarak Zen 2 kullanılarak görüntülerden elde edilen yoğunluk/zaman verilerine yerleştirildi.Geri kazanım eğrileri, moleküler difüzyonu hesaba katmak için tek üstel bir modele, edinim ağartma etkisini hesaba katmak için ek bir üstel terimle yerleştirildi.Daha sonra Kang ve arkadaşlarının denkleminde olduğu gibi nominal ağartma yarıçapını ve önceden belirlenen geri kazanım yarı ömrünü kullanarak D'yi hesapladık.5 35 gösterilmiştir.
αS'nin tek sistein varyantları, 24 (TEMPOL-24-aS) ve 122 (TEMPOL-122-aS) pozisyonlarında 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) ile sentezlendi, sırasıyla.Döndürme Etiketleme EPR deneyleri için aS konsantrasyonu 100 μM'ye ayarlandı ve PEG konsantrasyonu %15 (a/h) idi.Çeşitli toplama koşulları için aS:pLK oranı 1:10 iken aS:ΔNt-Tau ve aS:Tau441 oranları 1:1'de tutuldu.Kalabalıklığın olmadığı durumlarda bağlanma titrasyon deneyleri için TEMPOL-122-aS, ​​50 μM'de tutuldu ve polikatyonlar, her bir koşul ayrı ayrı hazırlanarak artan konsantrasyonlarda titre edildi.CW-EPR ölçümleri, ~9,7 GHz mikrodalga (SHF) frekansında çalışan bir Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatörüyle donatılmış bir Bruker ELEXSYS E580 X-bant spektrometresi kullanılarak gerçekleştirildi.Sıcaklık 25°C'ye ayarlandı ve bir sıvı nitrojen kriyostat ile kontrol edildi.Spektrumlar doymamış koşullar altında 4 mW MW gücünde, 0,1 mT modülasyon genliğinde ve 100 kHz modülasyon frekansında elde edildi.Spektral yoğunluklar, numuneler arasındaki dönüş konsantrasyonlarındaki farklılıkları ve Tau441 veya ΔNt-Tau (orijinal protein çözeltilerinde mevcut) içeren numunelerdeki indirgeyici maddelerin artık konsantrasyonları nedeniyle olası dönüş azalmasını önlemek için normalleştirildi.Verilen g değerleri, Matlab®67'de uygulanan Easyspin yazılımı (v. 6.0.0-dev.34) kullanılarak gerçekleştirilen EPR spektral modelleme sonucunda elde edilmiştir.Verileri modellemek için bir/iki bileşenli izotropik modeller kullanıldı.Tüm sinyallerin normalleştirilmesinden sonra artıklar, her bir simülasyonun karşılık gelen deneysel spektrumdan çıkarılmasıyla hesaplandı.Bağlanma titrasyonu analizi için, üçüncü bandın normalleştirilmiş EPR spektrumunun (IIII/III) ikinci bandına göreli yoğunluğu, polikatyonların aS'ye bağlanmasını izlemek için kullanıldı.Ayrışma sabitini (Kd) tahmin etmek için, elde edilen eğri, n adet aynı ve bağımsız bağlanma bölgesini varsayarak yaklaşık bir modele uyduruldu.
NMR spektroskopi deneyleri, bir kriyoprob ve Z-gradyanı ile donatılmış bir Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spektrometresi kullanılarak gerçekleştirildi.Tüm deneyler, 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, %10 D2O, pH 7,4'te 130–207 µM aS ve karşılık gelen aS/ΔNt-Tau ve pLK eşdeğerleri kullanılarak gerçekleştirildi ve 15°C'de gerçekleştirildi.LPS'yi NMR ile izlemek için önceden karıştırılmış numunelere %10 PEG ilave edildi.Kimyasal kayma pertürbasyon grafiği (Şekil 1b), ortalama 1H ve 15N kimyasal kaymaları gösterir.aS 2D1H-15N HSQC spektrumları önceki bir atamaya (BMRB girişi #25227) göre atandı ve HNCA, HNCO ve CBCAcoNH'nin 3D spektrumlarının kaydedilip analiz edilmesiyle doğrulandı.13Cα ve 13Cβ kimyasal kaymaları, saf rastgele bobin konformasyonu 68'deki aS kimyasal kaymalarına kıyasla ikincil yapı eğilimlerindeki olası değişiklikleri ölçmek için ΔNt-Tau veya pLK varlığında hesaplandı (Ek Şekil 5c).R1ρ oranları, hsqctretf3gpsi deneylerinin (Bruker kütüphanesinden elde edilen) 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 ve 800 ms gecikmelerle kaydedilmesiyle ölçüldü ve üstel fonksiyonlar, farklı hızlardaki tepe yoğunluk gecikmelerine ayarlandı. R1ρ'yi ve deneysel belirsizliğini belirlemek için zamanlar.
İki renkli zamanla çözümlenen floresans mikroskobu deneyleri, zamanla ilişkili tek foton sayma (TCSPC) cihazıyla ticari bir zamanla çözümlenen MT200 floresans konfokal mikroskobu (PicoQuant, Berlin, Almanya) üzerinde gerçekleştirildi.Lazer diyot kafası darbeli aralıklı uyarım (PIE) için kullanılır, ışın tek modlu bir dalga kılavuzundan geçer ve bir dikroik aynadan sonra ölçülen 481 nm ve 637 nm lazer çizgileri için 10 ila 100 nW lazer gücüne ayarlanır.Bu, foton örtüşme, foto-ağartma ve doygunluk etkilerinden kaçınarak optimum foton sayma oranını sağlar.μ-Slide anjiyogenez lamelleri veya plakaları (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almanya), düzeltici yakalı (Olympus Life Sciences, Waltham, ABD) bir Süper Apokromat 60x NA 1.2 lens üzerine doğrudan daldırma suyuna yerleştirildi.Ana ışın ayırıcı olarak 488/640 nm'lik bir dikroik ayna (Semrock, Lake Forest, IL, ABD) kullanıldı.Odaklanmamış radyasyon, 50 mikron çapında bir delik tarafından bloke edilir, ardından odaklanmış radyasyon, 50/50 ışın ayırıcı tarafından 2 algılama yoluna bölünür.Dedektörün önünde yeşil boya (AF488) için 520/35 ve kırmızı boya (Atto647N) için 690/70 bant geçiren emisyon filtreleri (Semrock, Lake Forest, IL, ABD) kullanıldı.Dedektör olarak tek fotonlu çığ diyotları (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, İtalya) kullanıldı.Hem veri toplama hem de analiz, ticari olarak temin edilebilen SymphoTime64 yazılımı (PicoQuant GmbH, Berlin, Almanya) kullanılarak gerçekleştirildi.
μ-Slide anjiyogenez kuyularına (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almanya) elli mikrolitre LLPS numunesi uygulandı.Ortaya çıkan görüntüler, asılı damlacıklar için optimum objektif çalışma mesafesi için kuyu tabanının 20 μm yukarısına ve en az 0,25 μm/piksel eksenel çözünürlük ve 400 μs/piksel gecikme süresiyle sallar ve noktalar için ~1 μm'ye odaklanır.Her kanal için ortalama arka plan sinyal yoğunluğuna (PBG, ortalama + 2σ) dayalı bir yoğunluk eşiği uygulayarak verileri seçin, böylece yalnızca sıvı protein damlacıkları, sallar veya noktalar seçilir ve dağınık fazdan olası herhangi bir köken filtrelenir.Her kanalın her türünün (τ) ömrünü analiz etmek için (AF488 için yeşil, "g" ve Atto647N için kırmızı, "r") damlacıklar, sallar veya noktalar içeren ilgi bölgelerini (ROI'ler) seçtik (Ek Şekil 1) ).(Şekil 8b) ve ömür boyu bozulmalarını (sırasıyla damlacıklar, sallar veya noktalar için τD, τR ve τP, sırasıyla Ek Şekil 8c'ye bakınız) bir kuyruk uyumu analizi ve iki bileşenli bir bozunma modeli kullanarak her kanala yerleştirerek türetmişlerdir.τ'dan ortalama τ.Çoklu üstel uyum için çok az foton üreten ROI'ler analizin dışında bırakıldı.Kullanılan kesme değeri sallar ve noktalar için <104 foton ve düşmeler için 103 fotondu.Damlacıklar daha düşük bir eşiğe sahiptir çünkü görüntü alanındaki damlacıklar genellikle daha küçük ve daha az sayıda olduğundan, daha yüksek yoğunluk değerlerine sahip bozunum eğrileri elde etmek zordur.Foton birikim sınırının üzerinde foton sayımlarına sahip ROI'ler (>500 sayım/piksel olarak ayarlanmış) da analiz için atıldı.Tüm yoğunluk azalmaları için aynısını korurken minimum IRF girişimi sağlamak için, ilgi alanından elde edilen yoğunluk azalma eğrisini, hizmet ömrünün başlangıcından itibaren maksimumun %90'ındaki bir yoğunlukla (bozulmanın maksimum yoğunluğundan biraz sonra) eşleştirin ayarlar Göreceli zaman penceresi Sallar ve noktalar için 25 ila 50 ROI ve düşmeler için 15-25 ROI analiz edildi; görüntüler, en az 3 bağımsız deneyden kaydedilen 4'ten fazla kopya arasından seçildi.Türler arasındaki veya koaservat sistemleri arasındaki istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için iki kuyruklu t testleri kullanılmıştır.Ömrün piksel piksel analizi için (τ), her kanalın alan üzerindeki ömrünün toplam zayıflaması hesaplandı ve 2/3 bileşenli üstel zayıflama modelinin bir yaklaşımı gerçekleştirildi.Her pikselin ömür boyu zayıflaması daha sonra önceden hesaplanan τ değerleri kullanılarak yerleştirildi ve sonuçta sahte renkli bir FLIM fit görüntüsü elde edildi.Kuyruk uyum ömrü aralığı, aynı kanalın tüm görüntülerinde aynıydı ve her bozunma, güvenilir bir uyum sağlamaya yetecek kadar foton üretti.FRET analizi için pikseller, ortalama 11 fotonluk bir arka plan sinyalinin (FBG) ortalaması olan 100 fotonluk daha düşük bir yoğunluk eşiği uygulanarak seçildi.Her kanalın floresans yoğunluğu deneysel olarak belirlenen düzeltme faktörleriyle düzeltildi: 69 spektral çapraz karışma α 0,004, doğrudan uyarma β 0,0305, tespit verimliliği γ 0,517 idi.Daha sonra piksel seviyesindeki FRET verimliliği aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
Burada FDD, donör (yeşil) kanalda gözlenen floresans yoğunluğudur, FDA, dolaylı uyarma altında alıcı (kırmızı) kanalda gözlenen floresans yoğunluğudur ve FAA, doğrudan uyarma altında alıcı (kırmızı) kanalda gözlemlenen floresans yoğunluğudur ( TURTA).Kanalda floresans yoğunluğu darbeleri gözlenir).
25 uM etiketsiz monomerik Tau441 (25 uM aS ile veya olmadan) içeren 100 ul LLPS reaksiyon solüsyonunu, yapışkan folyo kaplamalı bağlayıcı olmayan 96 oyuklu mikroplakalar üzerine LLPS tamponuna (yukarıdaki gibi takviye edilmiş) yerleştirin ve damlacık oluşumu, WF mikroskobu ile kontrol edildikten sonra kontrol edildi. dengeleme.10 dakika içindeOda sıcaklığında 48 saatlik inkübasyonun ardından protein salları ve lekelerinin varlığı doğrulandı.Daha sonra kuyulardan sallar üzerindeki sıvıyı dikkatlice çıkarın, ardından 50 L ayrışma tamponu (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin.Yüksek tuz konsantrasyonu, artık PEG nedeniyle LLPS'nin tekrarlanmamasını ve yalnızca elektrostatik etkileşimler tarafından oluşturulan olası protein düzeneklerinin parçalanmasını sağlar.Daha sonra kuyucuğun tabanı bir mikropipet ucuyla dikkatlice kazındı ve elde edilen çözelti, boş bir gözlem kuyusuna aktarıldı.Numunelerin 50 μM ThT ile 1 saat inkübasyonundan sonra izole noktaların varlığı WF mikroskobu ile kontrol edildi.7 gün boyunca bir yörünge çalkalayıcı üzerinde pH 7.4, sodyum azid %0.01 ve 37 °C'de %0.01 ve 200 rpm ile PBS'de 70 μM αS çözeltisinin 300 ul'sini inkübe ederek sonikasyona tabi tutulmuş αS fibrillerini hazırlayın.Daha sonra çözelti 9600 x g'de 30 dakika boyunca santrifüjlendi, pelet PBS pH 7.4 içerisinde yeniden süspanse edildi ve sonikasyona tabi tutuldu (1 dakika, %50 döngü, bir Vibra-Cell VC130 sonikatörde %80 amplitüd, Sonics, Newton, ABD) fibril numuneleri küçük fibrillerin nispeten eşit boyut dağılımına sahip.
FCS/FCCS analizi ve iki renkli tesadüf tespiti (TCCD), PIE modunu kullanan FLIM-FRET mikroskopi deneyleri için kullanılan aynı MT200 zamanla çözümlenen floresan konfokal mikroskopta (Pico-Quant, Berlin, Almanya) gerçekleştirildi.Bu deneyler için lazer gücü, 6,0 uW'ye (481 nm) ve 6,2 uW'ye (637 nm) eklendi.Bu lazer güçlerinin kombinasyonu, optimum sayım oranlarına ulaşırken ve ışıkla ağartma ve doygunluğu önlerken, kullanılan florofor çiftleri için benzer parlaklık üretmek üzere seçildi.Hem veri toplama hem de analiz, ticari olarak temin edilebilen SymphoTime64 sürüm 2.3 yazılımı (PicoQuant, Berlin, Almanya) kullanılarak gerçekleştirildi.
LLPS kullanılarak elde edilen izole edilmiş aS/Tau agrega örnekleri, izolasyon tamponunda uygun monomoleküler konsantrasyona kadar seyreltilir (agregatlar koaservat örneklerinden izole edildiğinde zaten düşük konsantrasyonlarda olduğundan tipik olarak 1:500 seyreltme).Numuneler, 1 mg/mL konsantrasyonda bir BSA çözeltisi ile önceden kaplanmış lamellere (Corning, ABD) doğrudan uygulandı.
Yeşil ve kırmızı kanallardaki PIE-smFRET analizi için, monomerik olayların neden olduğu düşük yoğunluklu sinyalleri filtrelemek için 25 fotonluk daha düşük bir yoğunluk eşiği uygulandı (monomerlerin izole edilmiş agregatlara kıyasla toplanmış numunelerden daha fazla olduğunu unutmayın).Bu eşik, analiz için agregatların özel olarak seçilmesi amacıyla saf monomer numunelerinin analizinden elde edilen monomerik aS'nin ortalama yoğunluğunun beş katı olarak hesaplandı.PIE sürücü devresi, TSCPC veri toplamayla birlikte, arka plan ve spektral karışmayı ortadan kaldırmaya yardımcı olan ömür boyu ağırlıklandırma filtresinin uygulanmasını mümkün kılmıştır.Yukarıdaki eşikler kullanılarak seçilen parlama yoğunluğu, yalnızca tampon örneklerinin yoğunluk/kutuya karşı oluşum histogramlarından belirlenen ortalama arka plan sinyali kullanılarak düzeltildi.Büyük agregatlarla ilişkili patlamalar genellikle zaman takibinde (1 ms'ye ayarlanmış) birkaç ardışık kutuyu kaplar.Bu durumlarda maksimum güçte bir kutu seçildi.FRET ve stokiyometrik analiz için teorik olarak belirlenen gama faktörü γ (0,517) kullanıldı.Spektral çapraz karışma ve doğrudan uyarma katkıları, kullanılan uyarma lazer gücünde ihmal edilebilir düzeydedir (deneysel olarak belirlenmiştir).Bir patlamada FRET'in verimliliği ve stokiyometrisi aşağıdaki şekilde hesaplanır.