ASTM A790 2507 /2205 1.4462 / 1.4410 Kimyasal endüstri için dubleks kaynaklı tüp, Specc1L eksikliği, eklemlerin artan stabilitesine ve kraniyal nöral krest hücrelerinin azaltılmasına yol açar.

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Sınırlı CSS desteğine sahip bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Ayrıca sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.

ASTM A790 2507 /2205 1.4462 / 1.4410 DUPLEX Kaynaklı Tüp Kimya Endüstrisi

Liaocheng Sihe SS Malzeme Co, Ltdpaslanmaz çelik dikişsiz borular, parlak tavlanmış tüpler, dikişsiz sarmal tüp vb.Müşterileri kolaylaştırmak için borular ve tüpler de var.Liaocheng Sihe SS Malzeme Co, LtdEn gelişmiş üretim ve test ekipmanına sahiptir.Gereksiniminizi tamamen karşılayabiliriz.Standard'a göre, tarafımızdan üretilen tüpler her zaman doğru OD ve WT toleransına sahiptir.Tolerans kontrolü kesinlikle standart üretmeye uygundur.Ürünlerimiz her zaman müşterilerden memnundur.Müşteriler ürünlerimizi daha fazla kar yarattı.
A) OD (dış çap): 3.18mm ila 101.6mm
b) WT (duvar kalınlığı): 0.5mm ila 20mm
C) Uzunluk: Müşterinin gereksinimine göre
d) Standartlar: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 vb.
e) İşlem yöntemi: ERW, EFW vb.

Slayt başına üç makale gösteren kaydırıcılar.Slaytlar arasında ilerlemek için geri ve ileri düğmelerini veya her slaytta ilerlemek için sondaki slayt denetleyici düğmelerini kullanın.
Kraniyal nöral krest hücreleri (CNCC) embriyonik nöral kıvrımlardan kaynaklanır ve orta yüz yapılarının çoğunu oluşturan faringeal kemerlere göç eder.CNCC disfonksiyonu, yaygın bir konjenital malformasyon olan orofasiyal yarık etiyolojisinde önemli bir rol oynar.Atipik ve sendromik yarıkları olan hastalarda heterozigot specc1L mutasyonları bulunmuştur.Burada, kültürlenmiş Specc1L yıkım hücrelerinde kanonik yapıştırıcı kavşak (AJ) bileşenleri, β-katenin ve E-cadherin'in gelişmiş boyandığını ve elektron mikrografları AJ'nin apikal-bazal difüzyonunu göstermektedir.Kraniyofasiyal morfogenezdeki Specc1L'nin rolünü anlamak için Specc1L eksikliği olan bir fare modeli oluşturduk.Homozigot mutantlar embriyonik ölümcüldür ve bozulmuş nöral tüp kapatılması ve CNCC laminasyonu sergiler.AJ protein boyaması mutant nöral kıvrımlarda artar.Bu AJ kusuru, AJ çözünmesi gerektiren CNCC delaminasyonundaki bir kusurla tutarlıdır.Ek olarak, Specc11 mutantları PI3K-AKT sinyalini ve artmış apoptozu azaltmıştır.İn vitro, vahşi tip hücrelerde PI3K-AKT sinyalinin hafif inhibisyonu AJ değişikliklerini indüklemek için yeterliydi.Önemli olarak, Specc1L yıkımı ile indüklenen AJ değişiklikleri, PI3K-AKT yolunun aktivasyonu ile tersine çevrilebilir.Birlikte ele alındığında, bu veriler PI3K-AKT sinyali ve AJ biyolojisinin yeni bir regülatörü olarak Specc1L'nin nöral tüp kapatılması ve CNCC tabakalaşması için gerekli olduğunu göstermektedir.
Kraniyal nöral krest hücreleri (CNCC'ler) dorsal nöroektoderm için lokalize olur ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) 1,2,3'ü içeren bir işlemle gelişmekte olan nöral kıvrımların nöroepitelyumundan ayrılır.Premigrasyon epitelyal CNCC'ler hücreler arası kavşakları bozar ve birinci ve ikinci faringeal kemerleri dolduran ve kraniyofasiyal kıkırdağın çoğunu oluşturan göç eden mezenkimal CNCC'ler haline gelir.Bu nedenle, CNCC fonksiyonunu düzenleyen genler, orofasiyal yarıklar gibi kraniyofasiyal konjenital anomalilerin etiyolojisinde genellikle sadece ABD'de 1/800 doğumları etkilemektedir.Konjenital deformitelerden biri8.
CNCC'nin delaminasyonu, farelerde ön nöral tüpün 8.5 ve 9.5 günlük embriyonik gelişim arasında kapatılmasıyla çakışır.Bir dizi fare orofasiyal yarık ilişkili genin mutantları, IRF69,10, GHRL310, CFL111 ve PDGFRa12 dahil olmak üzere bir çeşit nöral tüp kusuru sergiler.Bununla birlikte, nöral tüp kapatma ve CNCC tabakalaşması işlemleri bağımsız olarak kabul edilebilir, çünkü leke mutant faresi (PAX3), CNCC tabakalaşması veya göç 13,14 üzerinde herhangi bir etkisi olmaksızın nöral tüp kapatılmasında kusurlar sergiler.CNCC diseksiyonu ve nöral tüp kapatılmasında kusurlu ek fare modelleri, bu iki işlemin ortak moleküler temelini tanımlamaya yardımcı olacaktır.
CNCC'nin nöroepitelyal hücrelerden izolasyonu, diğerlerinin yanı sıra, e-cadherin, β-katenin, a-e-katenin ve aktin filamentleri 2 ile ilişkili a-aktin içeren protein komplekslerinden oluşan yapışkan bağlantıların (AJ'ler) çözülmesini gerektirir. Nöral kıvrımlardaki aşırı ekspresyon çalışmaları E-kaderin CNCC delaminasyonunda bir azalma veya gecikme göstermiştir.Tersine, E-kaderinin baskılanması erken tabakalaşma ile sonuçlanır15,16.CNCC tabakası sırasında EMT'ye aracılık eden faktörlerin çoğu transkripsiyon faktörleri (Ap2a, ID2, Foxd3, Salyangoz, Twist, Sox10) ve hücre dışı matris (ECM) Matris metaloproteinazlar (MMP) gibi yeniden şekillendirme proteinleridir, ancak CNCC'ler doğrudan sitoskülal AJ regülatörleridir. Henüz bilinmiyor.PI3K-AKT yolunun, esas olarak kanser araştırmalarından olan e-kaderin seviyelerini antagonize ettiği bilinmektedir17.Son çalışmalar, farelerde PDGFa bazlı PI3K-AKT sinyallerinin kaybının, yarık damak ve nöral tüp kusurları dahil olmak üzere kraniyofasiyal anormalliklere yol açtığını göstermiştir12.Bununla birlikte, PI3K-AKT yolu ile CNCC tabakalaşması üzerine AJ stabilitesi arasındaki ilişki belirsizdir.
Daha önce Specc1L'yi, ağızdan göze uzanan, eğik yarık (OBFC) veya Tessier IV18 yarık olarak bilinen iki kişide ilk mutant gen olarak tanımladık.Etkilenen bireylerin hiperdistance ve yarık dudak/damak sergilediği otozomal baskın opitz G/BBB sendromuna (OMIM #145410) sahip iki çok kuşaklı ailede Specc1L mutasyonları tanımlanmıştır ve Tibi aşırı dudak sendromu (OMIM #145420) 20 ile bir ailede 20 .Opitz G/BBB sendromu vakalarının yarısından fazlası X'e bağlıdır (OMIM #300000) ve mikrotübülle ilişkili hücre iskeletinin protein 22'sini kodlayan MID1 genindeki mutasyonlardan kaynaklanır.Mikrotübüller ve aktin hücre iskeleti ile ilişkili bir protein olan Specc1L'nin hücre adezyonu ve göç 18 sırasında aktin hücre iskeleti yeniden şekillenmesi için gerekli sinyallere aracılık edebileceğini varsayıyoruz.İn vitro ve in vivo çalışmalar yoluyla, artık Specc1L'yi PI3K-AKT sinyali yoluyla AJ stabilitesinin yeni bir düzenleyicisi olarak tanımlıyoruz.Hücresel düzeyde, Specc1L eksikliği, PAN-Akt protein seviyesinde bir azalma ve AJ'nin apikal bazal dağılımında bir artışa neden oldu, bu da AKT yolunun kimyasal aktivasyonu ile ortadan kaldırıldı.İn vivo, specc11 eksikliği olan embriyolar bozulmuş nöral tüp kapatma ve azaltılmış CNCC diseksiyonu gösterir.Bu nedenle, Yüz Morfogenezi sırasında normal CNCC fonksiyonu için gerekli olan yüksek düzeyde düzenlenmiş hücre yapışma bazlı sinyallemede Specc1L fonksiyonları vardır.
Specc1L'nin hücresel seviyedeki rolünü karakterize etmek için, daha önce tarif edilen stabil osteosarkom hücre hattı U2OS'un specc1l18'de eksik olduğunu kullandık.Specc1L (KD) yıkımı olan bu kararlı U2OS hücreleri, specc1L transkriptleri ve protein seviyelerinde orta derecede (%60-70) azalmaya sahipti, ayrıca aktin hücre iskeleti 18'in göçü ve yeniden düzenlenmesindeki kusurlar. Aksine, ciddi bir geçici azalma SPECC1L'nin mitotik kusurlara yol açtığı gösterilmiştir.Daha fazla karakterizasyon üzerine, stabil Specc1L-KD hücrelerimizin morfolojiyi çok yüksek bir izdiamda değiştirdiğini bulduk (Şekil 1).Bireysel kontrol hücreleri ve düşük birleşmedeki KD hücreleri benzer görünüyordu (Şekil 1A, D).Füzyondan 24 saat sonra, kontrol hücreleri küboidal şekillerini korurken (Şekil 1B, E), Specc1L-KD hücreleri uzadı (Şekil 1C, F).Hücre şeklindeki bu değişikliğin kapsamı, kontrol hücrelerinin ve KD hücrelerinin in vivo canlı görüntülemesi ile yakalandı (film 1).Konfluent hücrelerdeki Specc1L'nin rolünü belirlemek için ilk olarak ekspresyonunu inceledik.Specc1L protein seviyelerinin füzyon üzerine arttığını (Şekil 1G), specc1l transkript seviyelerinin artmadığını (Şekil 1H) bulduk.Ek olarak, hücre yoğunluğu arttıkça, specc1l proteini hücreler arası sınırlarda biriken (Şekil 2A-e), membran ile ilişkili β-katenin ile örtüşen bir patern (Şekil 2A'-e ').Specc1L'nin aktin hücre iskeleti 18,23 ile ilişkisi göz önüne alındığında, Specc1L'nin aktin bazlı yapışkan kavşaklar (AJ) ile etkileşime girdiğini varsaydık.
(AF) Specc1L yıkım (DF) hücreleri, kontrol U2OS hücrelerine (AC) kıyasla yüksek izdiham (F) 'de uzar.Burada farklı hücre yoğunlukları için seçtiğimiz altı zaman noktasından üçü (T1, T3, T6) gösterilmiştir.(G) Specc1L proteininin, kontrol hücrelerindeki düşük bir izdiham derecesine kıyasla yüksek derecede bir izdihamda stabilize edildiğini gösteren Western blot analizi.Specc1L'nin Western blotu, beklenen 120 kDa bandını ve muhtemelen translasyon sonrası modifiye edilmiş (*) daha yüksek bir moleküler ağırlık bandını gösterir.Western blot analizi, düşük ve yüksek birleşme için aynı koşullar altında gerçekleştirildi.Düşük ve yüksek birleşmede specc1L gösteren görüntüler aynı lekeden alınmıştır.Aynı leke çıkarıldı ve β-aktin antikoru ile yeniden incelendi.(H) Kantitatif RT-PCR analizi, Specc1L transkript seviyelerinde anlamlı bir değişiklik göstermedi.Hata çubukları dört bağımsız deneyden SEM'leri temsil eder.
(AE) Hücre şekli analizini normalleştirmek için bir dizi hücre yoğunluğunu temsil eden altı zaman puanı (T1-T6) seçtik ve Specc1L yıkımı (KD) ile U2OS hücrelerinde AJ değişiklikleri.Bu zaman noktalarının ilk beşi tek hücreler (T1), küçük hücre kümelerinin% 50-70 füzyonu, KD hücrelerini (T3) yeniden şekillendirmeden füzyon, KD hücrelerini yeniden şekillendirme (T4) ve 24 saatlik değişiklikleri içeriyordu.KD (T5) hücrelerinin arka formunda.Specc1L proteini ağırlıklı olarak T1 (A) 'da sitoplazmada dağıldı, ancak birikimi sonraki zaman noktalarında (B - E, oklar) hücreler arası sınırlarda gözlendi.(FJ) β-katenin, AJ kompleksi ile ilişkili hücreler arası sınırlarda benzer birikim gösterir.(A'-E ') Specc1L ve β-katenin, yüksek hücre yoğunluğunda (oklar) hücre sınırlarında üst üste binen boyamayı gösterir.(F'-j ') Specc1L-KD hücrelerinde, p-katenin boyaması düşük hücre yoğunluğunda (f'-h') normal görünür, ancak hücre şekli değişiklikleri (i ', j'; oklar) olarak genişler, bu da AJ olduğunu gösterir değişti.Çubuklar = 10 um.
Daha sonra Specc1L eksikliğinin AJ üzerindeki etkisini belirlemeye çalıştık.F-aktin, miyozin IIB, β-katenin ve E-kaderin kanonik bileşenleri dahil olmak üzere birkaç AJ ile ilişkili belirteç kullandık24,25,26,27.Daha önce tarif edildiği gibi Specc1L-KD hücrelerinde aktin stres lifleri artmıştır (Şekil 3a, b) 18.Aktin filamentleri ile ilişkili miyozin IIB, in vitro Specc1L-KD hücrelerinde benzer bir artış gösterdi (Şekil 3C, D).AJ ile ilişkili β-katenin, hücre zarındaki kaderin bağlanır ve kontrol kübositlerinde normal bir “petek” ekspresyon paterni gösterir (Şekil 3E, G).İlginç bir şekilde, konfokal mikroskopi, β-katenin (Şekil 3E, F) ve E-cadherin (Şekil 3G, H) kullanan düz görüntülerde, konfluent specc1L eksikliği olan hücrelerin hücre zarı üzerinde boyama, belirgin genişletilmiş boyama paternleri gösterdi.KD hücrelerinde AJ ile ilişkili β-katenin boyamasının bu genişlemesi en çok izdihamda belirgindi, ancak hücre şeklindeki değişikliklerden önce gelmiş gibi görünüyordu (Şekil 2F-J, F'-J ').Bu genişletilmiş AJ boyamasının fiziksel doğasını belirlemek için, transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) (Şekil 3i, J) ile Specc1L-KD U2OS hücrelerinin apikal-temel yüzeyinde hücre sınırlarını inceledik.AJ'yi (oklar) gösteren ayrı elektron yoğun bölgelerine sahip olan kontrol hücrelerinin (Şekil 3I) aksine, KD hücreleri (Şekil 3J), apikobazal düzlem boyunca AJ'nin göstergesi olan yüksek elektron yoğunluğunun bitişik bölgeleri gösterdi..Ek olarak, enine kesitlerde, β-katenin ve E-kaderin boyama bantlarının genişletilmiş paternini açıklayan KD hücrelerinde (Şekil S1A, B) geniş hücre zarı kıvrımları gözlemledik (Şekil 3F, H).AJS'de Specc1L'nin rolünü desteklemek için, β-katenin, konfluent U2OS hücrelerinin lizatlarında Specc1L ile birlikte immüno-çökeltildi (Şekil 3K).AJ belirteçleri için genişletilmiş immün boyama ile birlikte TEM analizi, Specc1L eksikliğinin AJ apikal-bazal yoğunluğunu ve varyansı arttırdığı hipotezimizle tutarlıydı.
(AH) KD hücrelerinde artan F-aktin boyaması, füzyondan 48 saatte (T6; A, B).F-aktin (C, D) ile ilişkili miyozin IIB'nin boyaması.Kontrol hücrelerinde (E, G) β-katenin ve E-kaderin membran boyamasının düzgün paterni, Specc1L-KD (F, H) hücrelerinde arttırıldı.Çubuklar = 10 um.(I-J) Apikal-bazal hücreler arası kavşağı gözlemleyen elektron mikrografları.Kontrol hücreleri, yapışkan kavşakları (I, oklar) gösteren farklı elektron yoğun bölgeler gösterir.Aksine, Specc1L-KD hücrelerindeki tüm apikal-temel kavşak, elektron yoğun (J, oklar) ortaya çıktı, bu da artmış yoğunluğunu ve yapışkan kavşakların dağılımını gösterdi.(K) β-katenin, konfluent U2OS hücre lizatlarında Specc1L ile birlikte immüno-çökeltildi.Dört bağımsız deneyden birini temsil eden bir noktadan alınan görüntü.
Kraniyofasiyal morfogenezdeki Specc1L'nin rolünü anlamak için, intron 1 ve Specc1L transkriptlerini temsil eden iki bağımsız ES tuzağı hücre çizgisi kullanarak DTM096 ve RRH048 (Baygenomics, CA) kullanarak bir Specc1L eksikliği fare modeli oluşturduk (Şekil 1) .4a, Şekil S2).Yeminli vektör ekinin genomik konumu, bütün genom sekanslaması ile belirlendi ve PCR ile doğrulandı (Şekil S2).Her iki gen tuzağı tasarımları da yakalama üzerine Specc11-Lacz muhabirlerinin çerçeve içi füzyonuna izin verdi.Bu nedenle, X-Gal boyama ile belirlenen LACZ ekspresyonu, Specc11 ekspresyonunun bir göstergesi olarak kullanıldı.Her iki alel de benzer LACZ ekspresyon paternleri gösterdi, intron 1'deki DTM096 gen tuzağı intron 15'te RRH048'den daha güçlü bir ekspresyon gösterdi (gösterilmemiştir).Bununla birlikte, Specc1L, E8.5'teki nöral kıvrımlarda (Şekil 4B), nöral tüpte ve E9.5 ve E10.5'teki yüz süreçlerinde (Şekil 4C, D) ve uzuvların geliştirilmesinde yaygın olarak eksprese edilir. E10'da.5 ve gözler (Şekil 4D).Daha önce E10.5'teki ilk faringeal kemerdeki Specc1L ekspresyonunun epitelyumda ve altta yatan mezenkim18'de CNCC soyuyla tutarlı olduğunu bildirmiştik.CNCC'de Specc1L ekspresyonunu test etmek için E8.5 nöral kıvrımlar (Şekil 4E-J) ve E9.5 kafatası bölümleri (Şekil 4K-) gerçekleştirdik.E8.5'te, NCC belirteçleri ile boyanmış hücreler dahil olmak üzere specc1l nöral kıvrımları yoğun bir şekilde boyanmıştır (Şekil 4E, H) (Şekil 4G, J).E9.5'te, AP2A (Şekil 4L, M) veya SOX10 (Şekil 4O, P) ile birlikte boyanmış güçlü bir şekilde boyanmış göç eden CNCC'nin güçlü bir şekilde lekelenmiş göç eden CNCC (Şekil 4O, P).
(A) ES DTM096 (intron 1) ve RRH048 (intron 15) hücre klonlarında tuzak vektör yerleştirme gösteren fare specc11 geninin şematik gösterimi.(BD) E8.5'ten E10.5'e Specc1L ekspresyonunu temsil eden heterozigot specc1LDTM096 embriyolarının LACZ boyaması.NE = nöroektoderm, NF = nöral kat, PA1 = ilk faringeal kemer.(EP) E8.5 (NF; EJ) nöral kıvrımlarda ve E9.5 (KP) kafatası bölümlerinde NCC markerleri AP2A ve SOX10 ile Specc1L immün boyama.Specc1L boyaması, AP2A (F, G; ok başları) ve Sox10 (I, J; ok başları) ile etiketlenmiş hücreler dahil olmak üzere E8.5 (E, H; ok başları) nöral kıvrımlarında yaygın olarak gözlenmiştir.E9.5'te Specc1L, AP2A (L, M; oklar) ve Sox10 (O, P; oklar) olarak etiketlenmiş güçlü bir şekilde göç eden CNCC'ler (K, N; oklar) boyanmıştır.
Heterozigot specc1ldtm096/+ ve specc1lrh048/+ fareleri arasında geçiş, iki gen tuzağı alelinin tamamlayıcı olmadığını ve her iki gen tuzağı alleli için bileşik heterozigotların ve embriyonik homozigotların embriyonik ölümcül (sofra S1) olduğunu göstermektedir.Mendel oranları, doğumda heterozigotların sağkalım oranında bir azalma olduğunu göstermiştir (1.34'e karşı 2.0).Heterozigotlar arasında düşük perinatal mortalite kaydettik, bazılarında kraniyofasiyal anomaliler vardı (Şekil S3).Bununla birlikte, bu perinatal kraniyofasiyal fenotiplerin düşük penetrasyonu, altta yatan patofizyolojik mekanizmaları incelemeyi zorlaştırmaktadır.Bu nedenle, homozigot specc11 mutantlarının embriyonik ölümcül fenotipine odaklandık.
Çoğu bileşik heterozigot veya homozigot specc1LDTM096/RRH048 mutant embriyoları, E9.5-10.5'ten sonra (Şekil 5A - D) gelişmedi ve nöral tüp anterior olarak kapanmadı (Şekil 5B, D) ve bazen posterior olarak kapalı (gösterilmedi) ..Bu kraniyal nöral tüp kapatma kusuru, E10.5'teki nöral kıvrımlarda kalan CNCC işaretli DLX2'nin çoğunluğu ile ilişkiliydi, bu da diseksiyonu göstermedi (Şekil 5A'-D ').CNCC'nin toplam boyutunun da azaltılıp azaltılmadığını belirlemek için, WNT1-CRE ve ROSAMTMG ile gen tuzağı hatlarımızda GFP ile CNCC çizgilerini etiketledik.Bütün embriyolardan NCC olmayan GFP+ NCC ve GFP- (RFP+) olmayan bir şekilde akış yapıyoruz.E9.5'te, akış sıralaması GFP etiketli CNCC'lerin oranı, WT ve mutant embriyolar (gösterilmemiştir) arasında önemli ölçüde değişmedi, bu da normal CNCC spesifikasyonunu gösterdi.Bu nedenle, açıkta kalan nöral kıvrımlarda (Şekil 5b ') artık Wnt1-Cre ve DLX2 boyamasının, muhtemelen Specc1L-KD hücrelerinde görüldüğü gibi, muhtemelen AJ hücrelerinin yoğunluğuna veya dağılmasına bağlı olarak kusurlu CNCC katmanına bağlı olduğunu varsaydık.Nöral katta CNCC varlığını doğrulamak için NCC markerleri SOX10, AP2A ve DLX2'yi kullandık (Şekil 5E-R).E8.5'te, WT (Şekil 5e, G, I) ve Specc1L mutant bölümlerinde (Şekil 5f, H, J) üç NCC markerinin tümü için nöral kat boyaması gözlenmiştir.E9.5'te, NCC markerleri NCC'yi WT kesitlerinde (Şekil 5M, O, Q) göç eden boyanırken, Specc1L mutant embriyolarının açıkta nöral kıvrımlarında artık NCC boyaması gözlenmiştir (Şekil 5n, P, R).Sox10 ve DLX2 işaretli CNCC'leri işaretlediğinden, bu sonuç Specc1L eksikliği olan CNCC'lerin göç sonrası spesifikasyona ulaştığını, ancak nöral kıvrımlardan geçemediğini göstermektedir.
Specc11 eksikliği, kusurlu nöral tüp kapatılmasına, kraniyal nöral krest hücrelerinin ve AJ'lerin delaminasyonuna yol açar.
(A, B ') WNT1-CRE (A') ile etiketlenmiş göç eden kraniyal nöral krest hücreleri (CNCC) taşıyan E9.5 (a) embriyo.Aksine, Specc11 mutant embriyoları, göç etmeyen (B ', ok başları) açık nöral kıvrımlar (B), ok uçları) ve CNCC'ler gösterir.(C, D ') E10.5 WT embriyolarının (C, C') ve Specc1L'nin (D, D ') CNCC markeri DLX2'nin parlak alan görüntüleri (C, D') ve immün boyama (C ', D').WT E10.5 embriyolarında, dlx2-pozitif CNCC, solungaç kemerlerini (c ', oklar) kolonileştirirken, mutantlarda, göze çarpan boyama açık nöral kıvrımlarda (d', oklar) ve ilk faringeal kemerlerde (D ', oklar).) CNCC'nin zayıf delaminasyonunu ve göçünü gösteren bazı boyama (oklar).ER) WT ve Specc1L mutant embriyolarının E8.5 (E - L) ve E9.5 (M - R) aşamalarındaki bölümleri, NCC belirteçleri SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) ve DLX2 (I, J, Q, R).E8.5'te, vahşi tip nöral kat (NF) ve mutant kesitlerde NCC boyaması gözlendi.Sox10 ve β-katenin'in E8.5 (K) ve mutant (L) içerisinde birlikte boyanması, nöral kıvrımlardaki hücre sınırlarında artan β-katenin boyamasını ortaya çıkardı.E9.5'te göç eden CNCC'lerin (M, O, Q) vahşi tip boyaması gözlenirken, mutantlarda, stratik olmayan CNCC'ler açık nöral kıvrımları boyanmıştır (N, P, R).(S - Z) WT ve Specc11dtm096/RRH048 embriyolarının Koronal bölümlerinde E9.5 mutasyonu ile in vivo AJ etiketleme analizi.Sağ üst köşede yaklaşık bir kesit düzlemi gösterilmiştir.Mutant dokularının kesitlerinde, F-aktin (S, T) ve miyozin Iib (U, V) boyamasının artmış olması gözlendi.Mutant embriyolarında Şekil 3'teki in vitro sonuçlara benzer şekilde, β-katenin (W, X) ve E-kaderin (Y, Z) için gelişmiş membran boyaması gözlendi.(AA-BB) Apikal-bazal hücrenin sınırının ötesine geçen vahşi tip bir embriyo bölümünün bir elektron mikrografı, yapışkan kavşakları (AA, oklar) gösteren farklı bir elektron-yoğun bölgeyi gösterir.Aksine, Specc11 mutant embriyolarının (BB, oklar) bölümlerinde, tüm apikobazal kavşak, elektron yoğundur, bu da artmış bir yoğunluğun ve yapışkan kavşakların dağılımını gösterir.
Azaltılmış tabakanın değiştirilmiş AJ'den kaynaklandığı hipotezimizi test etmek için AJ etiketlemesini Specc1L mutant embriyolarının açıkta olan nöral kıvrımlarında inceledik (Şekil 5S-Z).Aktin stres liflerinde bir artış gözlemledik (Şekil 5S, T) ve aktin lifleri üzerinde miyozin IIB boyamasının birlikte artan lokalizasyonu (Şekil 5U, V) gözlemledik.Önemli olarak, hücreler arası sınırlarda β-katenin (Şekil 5W, X) ve E-cadherin (Şekil 5y, Z) boyamasının artmış olduğunu gözlemledik.Ayrıca E8.5 embriyolarının nöral kıvrımlarında NCC'nin β-katenin boyamasını inceledik (Şekil 5K, L).β-katenin boyaması, Specc1L mutant nöral kıvrımlarında (Şekil 5L ve K) daha güçlü göründü, bu da AJ değişikliklerinin başladığını düşündürmektedir.E9.5 embriyolarının kafatası kesitlerinin elektron mikrograflarında, WT'ye kıyasla Specc1L mutant embriyolarında artan dağınık elektron yoğun boyama gözlemledik (Şekil 5AA, BB ve S1E-H).Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar Specc1L-KD U2OS hücrelerinde in vitro sonuçlarımızı destekler ve anormal AJ boyamasının mutant embriyolarımızda CNCC tabakalaşmasını öne sürdüğünü düşündürmektedir.
Akt aktivitesi ve e-kaderin stabilitesi arasındaki bilinen antagonistik ilişki göz önüne alındığında, 17,28 PI3K-AKT sinyalinin katılımını varsaydık.Ek olarak, E9.5-10.5'te ölümcüllükten (<%5) kaçan ve bunun yerine E13.5'e yerleşen bazı mutant embriyolarımızda subepidermal kabarma gözlemledik (Şekil S3).Subepidermal veziküller, PDGFRa12'ye dayanan azaltılmış PI3K-AKT sinyalinin ayırt edici özelliğidir.Fantauzzo ve ark.(2014), PDGFRAPI3K/PI3K mutant embriyolarında PDGFRa bazlı PI3K aktivasyonunun bozulmasının subepidermal veziküller, nöral tüp kusurları ve yarık damak fenotiplerine neden olduğunu bildirmiştir.Gerçekten de, PAN-AKT ve aktif fosforile SER473-AKT seviyeleri, Specc1L mutant dokularında in vivo olarak E9.5 embriyonik tutuklamaya indirildi (Şekil 6A-D).Fosforile SER473-AKT seviyelerindeki azalma, tamamen in vivo (Şekil 6E) ve in vitro PAN-AKT seviyelerindeki azalmaya bağlı olabilir (Şekil 6F).Bir in vitro azalma, sadece U2OS hücreleri hücre şekli ve AJ yoğunluğundaki değişikliklerle güçlü bir şekilde birleştiğinde gözlenmiştir (Şekil 6D).Bu nedenle, verilerimiz Specc1L'nin kraniyofasiyal morfogenezde PI3K-AKT sinyalinin yeni bir pozitif düzenleyicisi olduğunu göstermektedir.
(A-E) E8.5 (A, B) ve E9.5 (C, D) SPECC1L mutant embriyolarından (E) aktif fosforillenmiş S473-AKT ve PAN-AKT protein indirgeme seviyelerini gösteren E9.5 lizatları veya E9.5 lizatları , WT kontrolü ile karşılaştırıldığında.Western blotting, aynı koşullar altında vahşi tip lizatlar ve mutant lizatlar üzerinde gerçekleştirildi.Specc1L için gösterilen görüntüler bir lekeden alınmıştır.Aynı leke çıkarıldı ve anti-pan-aktif ve β-aktin antikorları ile yeniden incelendi.E8.5 nöral kıvrımlarındaki PAN-AKT seviyeleri (A, B) ve E9.5 kafatası bölümlerinde fosforile S473-AKT seviyeleri önemli ölçüde azaldı.(F) PAN-AKT seviyeleri, yüksek izdiamda hasat edilen Specc1L-KD U2OS hücrelerinin lizatlarında benzer şekilde azalmıştır.Hata çubukları, üç bağımsız Western blot nicemlemesinden SEM'leri temsil eder.(GJ) WT embriyolarının E9.5'te Ki67 ve yarılmış kaspaz 3 ile boyanmış, hücre proliferasyonu (G, G ') ve az apoptotik aktivite (H, H') gösteren bölümleri.Specc11 mutant embriyoları karşılaştırılabilir hücre proliferasyonu (I) gösterir, ancak apoptoz geçiren hücre sayısı önemli ölçüde artmıştır (J).
Daha sonra proliferasyon ve apoptoz belirteçlerini inceledik.WT mutantları için% 82.5 proliferasyon indeksi ve Ki67 boyaması ile ölçülen specc1L mutantları için% 86.5 olan E9.5 embriyolarının (Şekil 6E, G) proliferasyonunda herhangi bir fark gözlemlemedik (P <0.56, Fisher's, Fisher's, kesin test).Benzer şekilde, embriyo tutuklanmasına (gösterilmemiştir) (gösterilmemiştir) olana kadar klipsed kaspaz 3 için boyama ile ölçülen apoptozda herhangi bir fark gözlemlemedik.Aksine, tüm E9.5 mutant embriyolarında apoptoz önemli ölçüde artmıştır (Şekil 6F, H ve J).Apoptozdaki bu genel artış, azaltılmış PI3K-AKT sinyali ve erken embriyonik ölümcüllük ile tutarlıdır29,30,31.
Daha sonra, KD hücrelerimizdeki AJ değişikliklerinde PI3K-AKT sinyali için nedensel bir rolü doğrulamak için kontrol ve KD hücrelerindeki yolu kimyasal olarak değiştirdik (Şekil 7A-F).Bir marker olarak, en uzun boyutun (uzunluk) karşılık gelen dikey boyuta (genişlik) oranını kullanarak nicelleştirdiğimiz birleşmiş specc1L-KD hücrelerinde gözlemlenen hücre şekli değişim fenotipini kullandık.Nispeten yuvarlak veya küboidal hücreler için 1 oranı beklenir (Şekil 7G).Hücre şekline ek olarak, β-katenin boyaması ile AJ üzerindeki etkisini de doğruladık (Şekil 7A'-F ').Wortmannin kullanılarak PI3K-AKT yolunun inhibisyonu, kontrol hücrelerinde (Şekil 7A, C) ve AJ'de (Şekil 7A ') hücre şeklini değiştirmek için yeterliydi.PI3K-AKT aktivatörü SC-79, kontrol hücrelerinde hücre şeklini (Şekil 7a, E) veya AJ genişlemesini (Şekil 7A ') etkilemedi.Specc1L-KD hücrelerinde, PI3K-AKT yolunun daha fazla baskılanması, in vivo ağır mutantlarımızla tutarlı olarak artan apoptoz (Şekil 7B, D) ve β-katenin boyamasında belirgin bir artışla sonuçlandı.Önemli olarak, PI3K-AKT yolunun aktivasyonu, hücre şeklini (Şekil 7B, F) ve AJ fenotiplerini (Şekil 7B ”) önemli ölçüde geliştirdi.Hücre şeklindeki değişiklikler hücre yuvarlaklık oranı (CCR) olarak ölçüldü ve yukarıda tarif edildiği gibi anlamlılık açısından karşılaştırıldı (Şekil 7G).Gerçekten de, kontrol hücrelerinde (Şekil 7G, CCR = 1.56), Wortmannin tedavisi, gözlemlenene benzer şekilde hücre şeklini önemli ölçüde değiştirmek için yeterliydi (Şekil 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) specc1l'de.-KD hücreleri (Şekil 7G, CCR = 3.46).Specc1L-KD hücrelerinin (Şekil 7G, CCR = 3.60, ihmal edilebilir) Wortmannin tedavisi, tedavi edilmemiş KD hücrelerinden (Şekil 7G, CCR = 3.46, ihmal edilebilir) veya Wortmannin ile tedavi edilen kontrol hücrelerinden daha önemli değildi (Şekil 7G)., CCR = 3.46, ihmal edilebilir) ayrıca hücre uzamasını etkiler (7G, CCR = 3.61, ihmal edilebilir).En önemlisi, SC-79 Akt aktivatörü, Specc1L-KD hücrelerinin uzun fenotipini geri yükledi (Şekil 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Bu sonuçlar Specc1L'nin PI3K-AKT sinyalini düzenlediğini ve Specc1L'de orta derecede bir azalmanın hücre yapışmasını etkilediğini, güçlü bir azalmanın ise apoptoza yol açtığını göstermektedir (Şekil 8).
(A-F ') PI3K-AKT yol inhibitörü Wortmannin (C, D) veya SC-79 aktivatörü (E, F) işlemi ile muamele edilen kontrol (A, C, E) ve Specc1L-KD (B, D, F) hücreleri Treated kontrol hücreleri, normal β-Cat hücresel boyaması (A ') ile küboidal (A), KD hücreleri artmış β-Cat boyaması (B') ile uzatılır (B).PI3K-AKT yolunun baskılanmasından sonra, β-CAT genişlemesi (C ') ile uzanan kontrol hücreleri (C), KD hücreleri yüksek mutasyona uğramış embriyolarımıza benzer şekilde apoptoza (D) geçmeye başlar ve son derece gelişmiş β-cat gösterir.Boyama (D ').PI3K-AKT yolunun aktivasyonundan sonra, kontrol hücreleri küboidal (E) kaldı ve normal β-CAT (E ') boyamasına sahipken, KD hücreleri önemli ölçüde gelişmiş hücre şekli (F) ve β-CAT (F') boyaması gösterdi, bu da (G) (AF) 'deki hücre şekli değişim derecesi, en uzun boyutun (uzunluk) hücre yuvarlaklık oranı (CCR) ve Metamorph yazılımı kullanılarak karşılık gelen dikey boyut (genişlik) kullanılarak ölçüldü.Tedavi edilmemiş (NT) Specc1L-KD hücreleri (CCR = 3.46) kontrol hücrelerinden önemli ölçüde daha uzundu (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).WORT'nin kontrol hücrelerinde PI3K-AKT yolunun inhibisyonu, hücre şeklinde benzer bir uzamaya neden olmak için yeterliydi (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Benzer şekilde, SC-79 tarafından Specc1L-KD hücrelerinde Akt aktivasyonu, kontrol seviyelerine hücre uzamasını geri yükledi (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Specc1L-KD hücrelerinin wortmannin tedavisi, apoptozun artmasına neden oldu, ancak tedavi edilmemiş KD (CCR = 3.46, NS) veya Wortmannin ile muamele edilmiş kontrol hücrelerine (3.61) kıyasla hücre şekli değişiminde (CCR = 3.60) daha fazla artış göstermedi.ns = önemli değil.50 hücre için +/- SEM ölçümleri gösterilmiştir.İstatistiksel farklılıklar Student T-testi kullanılarak hesaplandı.
(A) PI3K-AKT yolunun inhibisyonunun ve aktivasyonunun şematik gösterimi, sırasıyla AJ değişiklikleri ve kurtarma ile sonuçlanır.(B) Specc1L tarafından Akt protein stabilizasyonu için önerilen model.
Premigrifer CNCC'ler, ön nöral kat nöroepitelyal hücrelerden ayrılmak için AJ liziz gerektirir1,15,32.AJ bileşenlerinin artan boyaması ve specc1L'den eksik hücrelerde specc1L ila β-katenin'in fiziksel yakınlığı ile birleştirildiğinde, specc1L eksikliği olan hücrelerde apikal-bazal AJ asimetrik dağılımının kaybı, specc1L'nin AJ lokal stabilitesini uygun şekilde korumak için işlev görmesini önermek Organizasyon kasları.aktin hücre iskeleti.Specc1L'nin aktin hücre iskeleti ve β-katenin ile ilişkisi ve specc1L yokluğunda yoğunlaştırılmış aktin filamentlerinin sayısındaki artış, AJ yoğunluğunda gözlenen artış ile tutarlıdır.Başka bir olasılık, Specc1L eksikliği olan hücrelerde artan sayıda aktin lifinin hücreler arası gerginlikte bir değişikliğe yol açmasıdır.Hücresel stres AJ 33 dinamiklerini etkilediğinden, voltaj değişiklikleri daha yaygın AJ 34 ile sonuçlanabilir.Böylece herhangi bir değişiklik CNCC katmanlarını etkileyecektir.
WNT1, nöral krest hücrelerine yol açan erken nöral kıvrımlarda eksprese edilir.Böylece, Wnt1-Cre soy izleme, NCC35'i hem ön hem de göç eden işaretler.Bununla birlikte, Wnt1 ayrıca, erken nöral kıvrımlardan 35,36'dan türetilen dorsal beyin dokusu klonlarını da işaret ederek, açık nöral kıvrımlarda Wnt1 belirteçleri için E9.5 mutantlarının boyamamızın CNCC olmamasını muhtemeldir.NCC belirteçleri AP2A ve SOX10 için pozitif boyamamız, Specc11 mutant embriyolarının açıkta kalan nöral kıvrımlarının gerçekten CNCC içerdiğini doğruladı.Ek olarak, AP2A ve SOX10 erken göç eden NCC'nin belirteçleri olduğundan, pozitif boyama, bu hücrelerin E9.5 tarafından tabakalandırılamayan göç sonrası CNCC olduğunu göstermiştir.
Verilerimiz, AJ'nin Specc1L ile moleküler regülasyonuna PI3K-AKT sinyali aracılık ettiğini göstermektedir.Akt sinyali, Specc1l eksik hücrelerinde ve dokularda azalır.Fantauzzo ve ark.Kraniyofasiyal morfogenezde PI3K-AKT sinyallemesi için doğrudan bir rolü destekleyin.(2014), PDGFRa bazlı PI3K-AKT sinyalinin aktivasyon eksikliğinin bir yarık damak fenotipine yol açtığını göstermiştir.Ayrıca, PI3K-AKT yolunun inhibisyonunun U2OS hücrelerinde AJ ve hücre şeklini değiştirmek için yeterli olduğunu gösteriyoruz.Bulgularımızla tutarlı olarak Cain ve ark.37, endotelyal hücrelerde PI3K a110 alt biriminin aşağı regülasyonunun, "bağlantı indeksi" nde bir artış olarak adlandırılan periküler p-katenin boyamasında benzer bir artışa neden olduğunu gösterdi.Bununla birlikte, aktin filamentleri zaten yüksek derecede organize olan endotelyal hücrelerde, PI3K-AKT yolunun baskılanması gevşek bir hücre şekli ile sonuçlanır.Aksine, Specc1L-KD U2OS hücreleri uzatılmış bir hücre şekli gösterdi.Bu fark hücre tipine özgü olabilir.PI3K-AKT sinyalinin baskılanması, aktin hücre iskeletini kalıcı olarak etkilerken, hücre şekli üzerindeki etki, merkezi aktin liflerinin yoğunluğundaki ve organizasyonundaki değişikliklerden kaynaklanan gerilim değişiklikleri ile belirlenir.U2OS hücrelerinde, specc1L eksikliği olan AJ değişikliği ve iyileşmesinin bir belirteci olarak sadece hücre şekli değişikliklerini kullandık.Sonuç olarak, Specc1L eksikliğinde AKT yolunun inhibisyonunun AJ stabilitesini arttırdığını ve CNCC'de delaminasyonu azalttığını varsayıyoruz.
İlginç bir şekilde, PAN-AKT seviyeleri, Specc1L yokluğunda fosforile 473-AKT seviyelerine ek olarak in vitro ve in vivo olarak azaltıldı, bu da PI3K-AKT sinyalinin Akt protein stabilitesi veya devir seviyesinde düzenlenmesini düşündürmektedir.Her ikisi de Opitz/GBBB sendromu ile ilişkili Specc1L ve Mid1 genleri, mikrotübülleri 18,22'yi stabilize eden proteinleri kodlar.Specc1l ve Mid1'in mikrotübül stabilizasyonuna aracılık ettiği mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır.Specc1L durumunda, bu stabilizasyon mikrotübül 18'in bir alt kümesinin artmış asetilasyonunu içerir.Specc1L'nin Akt gibi diğer proteinleri stabilize etmek için benzer bir mekanizma kullanması mümkündür.Akt proteinindeki lizin tortularının asetilasyonunun, membran lokalizasyonu ve fosforilasyonda bir azalmaya yol açtığı gösterilmiştir38.Ek olarak, Membran lokalizasyonu ve aktivasyonu için AKT üzerindeki aynı lizin tortusunda K63 zincirinin ubikitinasyonu gereklidir39,40.Çeşitli yüksek verimli maya iki hibrit ekranlarında tanımlanan Specc1L proteinleri ile etkileşime giren çeşitli faktörler arasında, dört-CCDC841, ECM2942, APC ve UBE2I43-, ubikitinasyon veya sumoylasyon yoluyla protein devir veya stabilitesinde rol oynamıştır.SPECC1L, Akt stabilitesini etkileyen Akt lizin kalıntılarının translasyon sonrası modifikasyonunda rol oynayabilir.Bununla birlikte, AKT proteininin lokalizasyonu ve stabilitesi Specc1L'nin kritik rolü açıklanmaya devam etmektedir.
İn vivo Specc1L ekspresyonundaki şiddetli kusurlar, AJ marker boyama ve kusurlu CNCC kaplamasının yanı sıra artan apoptoz ve erken embriyonik ölümcüllük ile sonuçlandı.Önceki raporlar, artan apoptoz seviyelerine sahip fare mutantlarının 44,45,46,47 ve kraniyofasiyal kusurlar ile ilişkili olduğunu göstermiştir48.Nöral kıvrımlarda veya faringeal kemerlerde aşırı hücre ölümünün, uygun morfogenetik hareket 48,49,50 için gerekli olan yetersiz sayıda hücreye neden olabileceği ileri sürülmüştür.Buna karşılık, orta derecede azaltılmış SpecC1L ekspresyonuna sahip Specc1L eksik hücre çizgilerimiz, artmış hücre ölüm kanıtı olmadan sadece AJ değişiklikleri gösterdi.Bununla birlikte, bu KD hücrelerinde PI3K-AKT yolunun kimyasal inhibisyonu, apoptozun artmasına neden oldu.Böylece, Specc1L ekspresyonunda veya fonksiyonunda orta derecede bir azalma, hücre hayatta kalmasını sağlar.Bu, ST'de tutuklamadan kaçan nadir Specc11 mutant embriyolarının gözlemiyle tutarlıdır.E9.5 - belki de azalmış gen yakalama verimliliği nedeniyle - nöral tüplerini kapatabilir ve daha sonra gelişimde, genellikle kraniyofasiyal kusurlarla durabilir (Şekil S3).Bununla birlikte, bununla da tutarlı olan kraniyofasiyal anormalliklere sahip heterozigot specc1L embriyolarının nadir görülmesi - muhtemelen artan gen yakalama verimliliği nedeniyle - iki Specc1L ortologdan (specc1lb) birinin geç embriyonik fenotiplerin neden olduğu zebra balığı bulgusu, geç embriyonik fenotiplere neden olduğu bulgudur. Alt çeneler ve bilateral yarıklar51.Bu nedenle, insan hastalarında tanımlanan heterozigot Specc1L fonksiyon kaybı mutasyonları, orofasiyal morfogenez sırasında specc1l fonksiyonunda orofasiyal yarıklarını açıklamak için yeterli bozulmalara neden olabilir.Hücre içi kontakların specc1l tabanlı düzenlenmesi, faringeal kemerlerin palatogenezinde ve füzyonunda rol oynayabilir.Specc1L fonksiyonunun daha fazla çalışması, nöroepitelyal hücre motilitesi ve kraniyofasiyal morfogenezde nöral tüp kapatılması sırasında CNCC'deki geçici hücreler arası kontakların rolünün açıklanmasına yardımcı olacaktır.
U2OS osteosarkom kontrolü ve Specc1L-KD hücreleri daha önce tarif edilmiştir (Saadi ve ark., 2011).Specc1L'ye karşı antikorlar da daha önce karakterize edilmiştir (Saadi ve ark., 2011).Anti-p-katenin antikorları (tavşan; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (fare; 1: 1000; hücre sinyal teknolojisi, Danvers, MA), miyozin IIB (1: 1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), Mo)), e-cadherin (1: 1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1: 1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), Sox10 (1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA), Fosfo-Ser473-AKT (1: 1000; Hücre Sinyali Teknolojisi, Danvers, MA), Pan-Akt (1: 1000; Thermofisher Scientific, Waltham, MA ), Ki67 (1: 1000; hücre sinyal teknolojisi, Danvers, MA), parçalanmış kaspaz 3 (1: 1000; hücre sinyal teknolojisi, Danvers, MA) ve β-aktin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tarif edildiği gibi kullanıldı..Aktin filamentleri akti-stain rhodamin phalloidin (hücre iskeleti, Denver, Colorado) ile boyandı.
U2OS kontrol hücreleri ve Specc1L-KD hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (Life Technologies, Carlsbad, CA) ile desteklenmiş standart yüksek glikoz DMEM'de kültürlendi.AJ değişiklikleri için 2 x 105 hücre,% 0.1 domuz jelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ile muamele edilmiş ve hücre şeklindeki değişiklikler için gözlemlendi.Hücreler farklı belirtilen zaman noktalarında toplandı: tohumlamadan 4 saat sonra (t = 1), tohumlamadan 24 saat sonra (t = 2), hücre şeklinde değişiklik (t = 3), hücre şeklinde değişiklik (t = 4) , Hücre şekli değişimden 24 saat sonra (t = 5) ve hücre şekli değişiminden 48 saat sonra (t = 6) (Şekil 1, 2, 3).PI3K-AKT yolunu modüle etmek için hücreler, belirtilen konsantrasyonlarda PI3K-AKT inhibitörü Wortmannin (Tocris Biosciences, Minneapolis, Minnesota) veya SC-79 aktivatörleri, Minneapolis Adams, Minnesota) ile kültürlendi.Kimyasalları içeren ortam günlük olarak değiştirildi.
Normal kültür koşulları altında canlı kontrol ve KD hücreleri üzerinde çerçeve çerçeve kayıtları yapıldı ve faz kontrast görüntüleri 7 gün boyunca her 10 dakikada bir toplandı.Görüntüler, mekanik bir aşama ve bir qimaging retiga-SRV kamerasına bağlı 10 × N plan hedefi ile donatılmış bir bilgisayar kontrollü Leica DM IRB ters mikroskop kullanılarak elde edildi.Görüntüleme sırasında hücre kültürleri,% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de tutuldu.
Bölgesel mutant fare Kaynak Merkezi'nden (UC Davis, CA) iki gen tuzağı ES hücre çizgisi DTM096 ve RRH048, specc11 eksik fare çizgileri üretmek için kullanıldı, specc1lgtdtm096 ve specc1lgtrrh046 olarak adlandırıldı.Kısaca, C57BL6 blastosistlerine 129/rej ES hücreleri enjekte edildi.Ortaya çıkan kimerik erkek fareler, Agouti ceket renklendirme ile yavruları tanımlamak için dişi C57BL6 fareleri ile yetiştirildi.Heterozigotları tanımlamak için gen tuzağı vektör eklerinin varlığı kullanıldı.Fareler, 129/rej; C57BL6 karışık bir arka plan üzerinde tutuldu.Genetik tuzak vektörünün yerleştirme bölgesinin yeri RT-PCR, genom sekanslaması ve genetik tamamlama ile doğrulanmıştır (Ek Şekil 1).Çift heterozigot specc1LGT farelerinin CNCC soyunu izlemek için ROSAMTMG (#007576) ve WNT1-CRE (#003829) fareleri (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me), specc1l mutant embriyosunda rosamtmg ve wnt1-cre aleli üretmek için geçti.Farelerdeki tüm deneyler, Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre yapıldı.
Embriyolar, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca (% 1 formaldehit,% 0.2 glutaraldehid, 2 mM MgCL2,% 0.02 NP-40, 5 mM EGTA) içinde sabitlendi.X-Gal boyama çözeltisine (5 mM potasyum ferrisiyanid, 5 mM potasyum ferrosiyanid, 2 mM mgcl2,% 0.01 sodyum deoksikolat,% 0.02 NP-40, 1 mg/mL X-Gal) leke gelişimi 37 ° C'de gerçekleştirildi. .° C 1-6 saat içinde.Embriyolar% 4 PFA içinde sabitlendi ve görselleştirildi.
Western blotlama için hücreler, HALT proteaz inhibitörlerinin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) bir karışımı ile desteklenmiş pasif liziz tamponu (Promega, Fitchburg, WI) içinde lize edildi.Lizatlar,% 12 poliakrilamid mini-protean TGX hazır jeller (Bio-Rad, Hercules, CA) üzerinde işlendi ve Immobilon PVDF membranlarına (EMD Millipore, Billerica, MA) aktarıldı.Membranlar,% 0.1 Tween içeren PBS içinde% 5 süt içinde bloke edildi.Antikorlar gece boyunca 4 ° C'de veya bir saat oda sıcaklığında inkübe edildi.Sinyal üretimi için FEMTO SuperSignal West ECL reaktifi (Thermo Scientific, Waltham, MA) kullanıldı.İmmün boyama için embriyolar gece boyunca% 4 PFA/PBS içinde sabitlendi ve kriyopresinde tutuldu.Doku kriyozeksiyonları% 1 normal keçi serumu (Thermo Scientific, Waltham, MA) ve% 0.1 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) içeren PBS içinde bloke edildi ve daha sonra 4 ° C'de bir inkübatörde 4 ° C'de inkübe edildi. gece.4 ° C'de 1 saat boyunca anti-antikor ve floresan ikincil antikor (1: 1000) ile.Boyanmış bölümler uzatma altın ortamına (Thermo Scientific, Waltham MA) yerleştirildi ve düz görüntüler bir Leica TCS SPE konfokal mikroskobu kullanılarak elde edildi.Her immüno -boyama, en az iki mutant embriyonun zirveleri üzerinde üç bağımsız deney olarak gerçekleştirildi.Temsili bir deney gösterilmiştir.
Hücreler modifiye RIPA tamponu (20 mM Tris-HCL, pH 8.0,% 1 NP-40, 130 mM NaCl,% 10 gliserol, 2 mM EDTA ve durma proteaz inhibitörü (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) içinde inkübe edildi. Kısaca, lizatlar protein G manyetik boncukları (Life Technologies, Carlsbad, CA) ile hazırlandı ve daha sonra gece boyunca 4 ° C'de inkübe edildi. -p-katenin antikoru, gösterilen CO-IP deneylerinin üzerinde tarif edilen dört bağımsız deneyin temsilcisidir.
Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki elektron mikroskopi merkezine sabit kültürlenmiş hücreler veya fare embriyonik dokuları sağlandı.Kısaca, numuneler 812 reçineye (elektron mikroskopi bilimleri, Fort Washington, PA) gömüldü, gece boyunca 60 ° C'de polimerize edildi ve bir elmas bıçağı ile donatılmış bir Leica UC7 ultramikrotom kullanılarak 80 nm'de kesildi.Bölümler, 100 kV lab6 tabancası ile donatılmış bir JEOL JEM-1400 iletim elektron mikroskobu kullanılarak görüntülendi.
Bu makaleyi nasıl belirtilir: Wilson, Nr ve ark.Specc1L eksikliği, eklemli eklemlerin stabilitesinin artmasına ve kraniyal nöral krest hücrelerinin azalmasına yol açar.Bilim.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Nöral krest indüksiyonu ve farklılaşması.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, Dr ve ark.Hareket halindeki kraniyal nöral kret hücreleri: kraniyofasiyal gelişimdeki rolleri.Amerikan Tıbbi Genetik Dergisi.Bölüm A 155A, 270-279, doi: 10.1002/ajmg.A.33702 (2011).
Boland, RP nörokristopati: 20 yılı aşkın büyümesi ve gelişmesi.Çocuk doktoru.patoloji.laboratuvar.ilaç.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig Ku ve Noten MM orofasiyal yarıkların genetiğinde atılım.Moleküler tıpta eğilimler 17, 725-733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ve Riley, kraniyofasiyal gelişim sırasında kraniyal nöral krest hücre göçü ve deseninin FM moleküler mekanizmaları.Geliştirme 137, 2605-2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, Th ve Murray, JK yarık dudağı ve damak: Genetik ve çevresel etkileri anlamak.Doğal yorum.Genetik 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, Cr ve ark.İnterferon düzenleyici faktör-6 (IRF6) yetersiz farelerde cilt, uzuvlar ve kraniyofasiyal bölgenin anormal morfogenezi.Ulusal Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. ve ark.GRHL3'teki baskın mutasyonlar van der Waord sendromuna ve oral periderm'in gelişimini bozar.J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ve Juriloff, DM nöral tüp kapatılmasında kusurlu fare mutantları listesini güncelleyin ve nöral tüp kapatılmasının tam bir genetik anlayışına doğru ilerleme.Doğum kusurlarının araştırılması.Bölüm A, Klinik ve Moleküler Teratoloji 88, 653-669, DOI: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, Ka ve Soriano, P. PI3K aracılı PDGFRALPHA sinyalleri, p53'e bağımlı bir hücre içi yol yoluyla iskelet gelişiminde hayatta kalmayı ve proliferasyonu düzenler.Gen Gelişimi 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
KOPP, AJ, Green, ND ve Murdoch, JN Dağınık: Yakınsak genişlemenin nöral tüp kapatılmasıyla ilişkisi.Nörolojide eğilimler.26, 453–455, doi: 10.1016/s0166-2236 (03) 00212-1 (2003).