347 paslanmaz çelik sarmal boru kimyasal bileşeni, Çapraz bağlı kütle spektrometresi (CLMS) kullanılarak yeni interferona duyarlı insan lökosit antijen-A (HLA-A) şaperon proteinlerinin tanımlanması

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Sınırlı CSS desteğine sahip bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Ayrıca sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Slayt başına üç makale gösteren kaydırıcılar.Slaytlar arasında ilerlemek için geri ve ileri düğmelerini veya her slaytta ilerlemek için sondaki slayt denetleyici düğmelerini kullanın.

Ürün Açıklaması

Paslanmaz Çelik 347L Bobin Boruları, Çelik Sınıfı: SS347L

İnterferon sinyalleme sistemi, çevreden gelen çok çeşitli patojenik ve içsel patolojik sinyallere karşı güçlü bir sitokin tepkisini indükleyerek, interferonla indüklenebilir proteinlerin alt kümelerinin indüklenmesiyle sonuçlanır.İnterferonun indüklediği proteinler alanındaki yeni protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için DSS aracılı çapraz bağlı kütle spektrometrisini (CLMS) uyguladık.Beklenen interferonla indüklenebilir proteinlere ek olarak, MX1, USP18, OAS3 ve STAT1 gibi kanonik interferonla indüklenebilir proteinlerin yeni moleküller arası ve moleküller arası çapraz bağlı eklentilerini de belirledik.Ortak immünopresipitasyon kullanılarak HLA-A proteinleri (H2BFS-HLA-A-HMGA1) tarafından oluşturulan yeni bir dizi interferonla indüklenebilir protein ağlarının ortogonal doğrulanmasına ve bunların moleküler dinamik modelleme kullanılarak daha ileri çalışmalarına odaklandık.Protein kompleksinin konformasyonel dinamiklerinin modellenmesi, CLMS bulgularında tanımlanan etkileşimleri yansıtan çeşitli etkileşim bölgelerini ortaya çıkardı.Birlikte, interferon tarafından indüklenen yeni sinyal komplekslerini tanımlamak için CLMS'ye ilişkin bir pilot çalışma sunuyoruz ve tümör mikroçevresindeki protein etkileşimlerinin yeni dinamiklerini tanımlamak için CLMS'nin daha geniş kullanımını sabırsızlıkla bekliyoruz.
Uyarlanabilir bir bağışıklık tepkisi başlamadan önce, konağın doğuştan gelen savunma sistemi, interferonlar (IFN'ler) adı verilen, salgılanan bir alfa-sarmal sitokin ailesinin aracılık ettiği bir antimikrobiyal tepki oluşturur.Tip I IFN sınıfları IFNa ve IFNβ, antiviral, proapoptotik, proinflamatuar ve antiproliferatif durumlar dahil olmak üzere hücresel tepkileri aktive eder.İnsanlarda IFNa'nın 13 alt tipi bilinmektedir ve hepsi kromozom 91 üzerinde kümelenmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, klinik kullanım için yalnızca IFNa2 incelenmiştir.Son zamanlarda IFNa'nın diğer alt tipleri üzerine araştırmalara özel önem verilmiştir.Yakın zamanda yapılan bir çalışma, IFNa14'ün, kanonik IFNa2 alt tipiyle karşılaştırıldığında HBV2 ve HIV-13,4 replikasyonunu kısıtlamada en etkili izoformlardan biri olduğunu gösterdi.
Aktive edilmiş tip I interferon reseptör komplekslerinin (IFNAR1 ve IFNAR2), Janus kinazlar TYK2 ve JAK15,6'nın aracılık ettiği bir sinyal iletim kademesini tetiklediği tespit edilmiştir.Bu Janus kinazlar, SH2 alanı aracılı heterodimerizasyonu başlatmak için sinyal transdüserlerini ve transkripsiyonel protein aktivatörlerini (STAT1 ve STAT2) tirozin kalıntıları üzerinde fosforile eder6.Daha sonra IRF9, çekirdeğe yer değiştiren ve 2000'den fazla interferonla uyarılan genin (ISG'ler)5,6,7,8 transkripsiyonunu indükleyen IFN ile uyarılan faktör 3 geninin (ISGF3) trimerik bir kompleksini oluşturmak için STAT heterodimerlerini bağlar.
ISG'ler, özellikle viral saldırıya yanıt olarak, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin omurgasını oluşturur.Viral enfeksiyona karşı ilk savunma hattı olarak hücreler, hücresel proteinlerin çok çeşitli biyolojik aktivitelerle kapsamlı etkileşimlerini hızla harekete geçirir.Bu proteinler arasında desen tanıma reseptörleri, sinyal molekülleri, transkripsiyon faktörleri ve doğrudan antiviral işlevlere sahip proteinlerin yanı sıra bağışıklık tepkilerinin negatif düzenleyicileri de bulunur9.ISG aktivitesine ilişkin bilgilerin çoğu, bireysel ISG'lerin eksprese edildiği veya inhibe edildiği ve aktivitelerinin çeşitli virüsler üzerinde test edildiği aşırı ekspresyon taramaları10,11 veya gen susturma teknikleri (siRNA, RNAi ve CRISPR)12,13 kullanan fonksiyonel ekranlardan gelir.Her ne kadar bu çalışmalar bireysel ISG'lerin antiviral özelliklerini belirlemiş olsa da, her bir ISG'nin altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir.Tam aktiviteyi sağlamak için birçok proteinin bir veya daha fazla sitokinle etkileşime girdiği genel olarak kabul edilir, dolayısıyla ISG'ler doğrudan etkileşime girer veya etkileşimlerine hücresel proteinler aracılık eder.Örneğin, yeni bir foto-çapraz bağlantılı proteomik çalışması, ATPase VCP/p97'yi, inhibisyonu lizozomal sıralamada, dönüşümde ve IFITM3'ün viral partiküllerle birlikte taşınmasında kusurlara yol açan önemli bir IFITM3 etkileşim ortağı olarak tanımladı14.İmmünopresipitasyonu kullanarak, vezikülle ilişkili bir protein olan VAPA'yı, kolesterol aracılı viral olgunlaşmaya aracılık eden IFITM1/2/3 ile etkileşim ortağı olarak belirledik ve bu, bir maya iki hibrit sistemi kullanan başka bir çalışma ile doğrulandı.Bilimsel Destek 15, 16.
Enfeksiyonun ve malign transformasyonun baskılanmasında yer alan temel bir biyolojik süreç, majör doku uyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin aracılık ettiği antijen sunumudur.Bölünmüş, zamanından önce sonlandırılmış veya yanlış katlanmış proteinlerden gelen peptitler (8-12 amino asit uzunluğunda), MHC-I heterodimerine (β-2-mikroglobulin olarak adlandırılan MHC-I ağır ve hafif zincirlerden oluşur; β2M)17,18 yüklenir.Ortaya çıkan stabil MHC-I trimerleri hücre yüzeyine taşınır ve burada hücre içi peptitleri CD8+ T hücrelerine (sitotoksik T hücreleri)17 sunarlar.T hücreleri bu patojenleri ve tümöre özgü bir antijen taşıyan hücreleri tanır ve yok eder.Sonuç olarak patojenler ve tümör hücreleri, bağışıklık gözetiminden kaçınmak için sıklıkla antijen sunum sürecini baskılar.Ek olarak, MHC-I insan tümörlerinin %40-90'ında aşağı regüle edilir ve sıklıkla daha kötü prognozla ilişkilendirilir19.
Patojenlere yanıt veren genlerin, dinlenme durumu ile aktif transkripsiyon durumu arasında hızlı bir şekilde geçiş yapması gerekir.Bu nedenle, çeşitli hücresel proteinlerin, promotör kromatin 20,21'in yeniden yapılanması ve modifikasyonu da dahil olmak üzere, kısa süreler boyunca yüksek IFN talebine yanıtta yer aldığı varsayılmaktadır.Çoğu çalışma, IFN varlığında bireysel ISG protein ortaklarının tanımlanmasına odaklanmıştır.Model hücre sistemlerindeki çeşitli proteomik ve transkriptomik çalışmalar, IFN'nin hücresel manzara üzerindeki etkisini açıklığa kavuşturmuştur.Bununla birlikte, interferonların neden olduğu dinamiklerin giderek daha iyi anlaşılmasına rağmen, ISG'lerin katılımı hakkında hala çok az şey biliyoruz.İnterferon sinyallemenin karmaşıklığı ve zamana bağlı dinamikleri göz önüne alındığında iki soru ortaya çıkar: (i) hızlı sinyallemede yer alan çoklu protein komplekslerini stabilize etmek ve yakalamak mümkün müdür ve (ii) bu etkileşimler 3 boyutlu uzaya haritalanabilir mi?
Bu sorunları çözmek için, IFNa'nın indüklediği protein etkileşim ağını ve dinamiklerini incelemek için kütle spektrometrisi (CLMS) ile birlikte disüksinimit suberat aracılı kimyasal çapraz bağlamayı (DSS) uyguladık.DSS, in vivo proteinlerin ve/veya protein komplekslerinin yakın kalıntıları arasına kovalent bağlar ekler.Sonraki MS analizi, iç bağlantılar adı verilen belirli bir protein içindeki bölgelerin veya karşılıklı ilişkiler adı verilen protein komplekslerindeki alt birimlerin uzamsal yakınlığını yansıtan spesifik çapraz bağlanma bölgelerini ortaya çıkarır.Bu yaklaşımı kullanarak, birçok yeni protein-protein kompleksinin yanı sıra interferon kaynaklı çoklu protein etkileşim ağlarını da belirledik.Bu yeni etkileşimlerin bir alt kümesini daha fazla test ederek, H2BFS'nin (H2B histon tipi FS; bundan sonra H2B olarak anılacaktır) ve MDN1'in HLA-A için bağlayıcı ortaklar olarak hareket ettiğini gösterdik.
Flo-1 hücreleri, özofagus tümörlerinin temel özelliklerini taklit ettikleri için özofagus adenokarsinomunun en iyi bilinen in vitro modellerinden biridir22,23.Ancak tüm tümörler immünojenik değildir ve Flo-1 hücrelerinin interferon tedavisine yanıt verip vermediğini belirlemek için Flo-1 hücrelerini 72 saat boyunca 10 ng/ml IFNa ile tedavi ettik.Flo-1 hücreleri, tedaviden 2 saat sonra başlayan ve 72 saat boyunca devam eden, IRF1'in sabit seviyelerinde zamana bağlı bir düşüşle pSTAT1 ve IRF1'in erken indüksiyonunu gösterdi (Şekil 1A).ISG'lerin (MX1, IFITM1, OAS1/2 ve ISG15), IFNa'ya klasik orta ve geç faz yanıtlarını taklit ederek 6 saat sonra güçlü bir şekilde indüklendiği bulundu (Şekil 1A).Bu veriler birlikte, bu hücresel modelin interferon yanıtlarını incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir.
IFNa tedavisinden sonra Flo-1 hücrelerinde farklı protein ekspresyonu yanıtları.(A) 2, 6, 24, 48 ve 72 saat boyunca 10 ng/ml IFNa ile işleme tabi tutulan Flo-1 hücrelerindeki protein ekspresyonu, belirtilen ISG antikorları kullanılarak immünoblot yoluyla analiz edildi.(B) Belirtilen süreler ve konsantrasyonlar için DSS ile çapraz bağlanmanın ardından tüm hücre özlerinin Coomassie mavisi ile boyanmış SDS-PAGE jelleri.(C) Protein çapraz bağlanma derecesini değerlendirmek için aynı örneklerden p53(DO-1) antikoru ile incelenen temsili immünoblot.
Yerinde protein etkileşimi manzarasını yakalamak için, yüksek membran geçirgenliği ve nispeten kısa reaksiyon süresi nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir çapraz bağlama maddesi olan DSS'yi kullandık.Daha kısa reaksiyon süresi, büyük çapraz bağlı protein kümelerinin oluşumunun önlenmesine yardımcı olur, böylece çapraz bağlayıcının stabilitesi korunur.Optimum DSS konsantrasyonunu belirlemek ve aşırı çapraz bağlanmayı önlemek için önce hücreleri sırasıyla 5, 10, 5 ve 30 dakika boyunca 5, 2,5 ve 1 mM DSS'ye maruz bıraktık ve lizatları Coomassie ile boyanmış SDS-PAGE ile analiz ettik. (veri gösterilemiyor) .Hücre lizatlarının en düşük konsantrasyonda ve en kısa zaman noktasında oldukça çapraz bağlı olduğu görülmektedir.Bu nedenle DSS, 5 dakika içinde 1, 0,5 ve 0,1 mM'ye titre edildi (Şekil 1B).Optimum çapraz bağlanma, 0,5 mM DSS ile 5 dakika süreyle gözlemlendi ve bu koşullar, IFNa ile tedavi edilen hücreler için seçildi.Ek olarak Şekil 1C, protein çapraz bağlanma derecesini değerlendirmek için p53 (DO-1) antikoru kullanılarak gerçekleştirilen bir Western blot'u gösterir.
Flo-1 hücreleri, çapraz bağlayıcının eklenmesinden önce 24 saat boyunca 10 ng/ml IFNa ile işlendi.Çapraz bağlı hücreler daha sonra iki aşamalı proteoliz ile parçalandı ve proteinler FASP ile işlendi (Şekil 2)24,25.Çapraz bağlı triptik peptidler kütle spektrometresi ile analiz edildi (Şekil 2).MS/MS spektrumları daha sonra protein dizisiyle eşleştirilir ve MaxQuant26,27 ile ölçülür.Çapraz bağlı peptitler, SIM-XL programı kullanılarak elde edilen spektrumlardan tanımlandı ve tek tek bileşikler, xQuest28 ve SIM-XL29 açık kaynaklı hesaplama yazılımı boru hatları kullanılarak karmaşık bir ağ halinde birleştirildi (Şekil 2).SIM-XL, basit veya karmaşık protein karışımlarındaki protein-protein etkileşimlerini, iç zincirleri ve ayrı zincirleri tanımlar ve protein yapılarındaki etkileşimleri görselleştirmek için komut dosyaları sağlar.Ayrıca her çapraz referansı MS/MS29 spektrum kalitesine göre bir ID puanı olarak sıralar.Son derece güvenilir birkaç protein-protein etkileşimi ve kompleksi tanımlanmış ve moleküler dinamik (MD) modelleme (Şekil 2) 30, 31 kullanılarak ortak immünopresipitasyon ve komplekslerin konformasyonel değişiklikleri kullanılarak yeni bir etkileşim seti daha da araştırılmıştır.
CLMS yöntemine şematik genel bakış.Flo-1 hücreleri 24 saat boyunca 10 ng/ml IFNa ile muamele edildi, ardından DSS kullanılarak yerinde protein çapraz bağlanması ve ardından hücre lizizi ve trypsinizasyon yapıldı.Çapraz bağlı numuneler, bir Orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak analiz edildi ve ayrıca LC-MS/MS sırasında peptit öncüllerinin parçalanması açısından örneklendi.Çapraz Bağlı Peptitler Spektrum Tanıma Makinesi (SIM-XL) programı kullanılarak elde edilen spektrumlardan iki bağlantılı peptit tanımlandı ve tüm bileşikler, hesaplamalı boru hatları kullanılarak karmaşık bir ağ halinde birleştirildi.Yanlış pozitif oran (FDR) puanlarına dayalı olarak düşük güvenilirliğe sahip etkileşimleri filtreleyin.Birkaç yeni yüksek kaliteli protein-protein etkileşimi, ortak immünopresipitasyon kullanılarak daha da doğrulandı ve komplekslerdeki konformasyonel değişiklikler, moleküler dinamik (MD) modelleme kullanılarak incelendi.
Uyarılmamış ve uyarılmış IFNa örneklerinde sırasıyla MaxQuant kullanılarak toplam ~30.500 ve ~28.500 peptid tespit edildi (Ek Tablo S1, Şekil 3A).Her iki durumda da peptit uzunluğu dağılımı, çapraz bağlı peptitlerin varlığını gösteren daha yüksek oranda daha büyük peptitler gösterdi (Şekil 3B,C).Ek olarak, IFNa ile tedavi edilen numunelerde 40-55 aralığında daha büyük oranda daha büyük peptitler mevcuttu (Şekil 3C).Log2 yoğunluğuna karşı protein haritalaması, klasik interferonla uyarılmış proteinlerin, MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 ve HLA-F dahil olmak üzere işlenmemiş numunelerle karşılaştırıldığında en bol miktarda olduğunu gösterdi (Şekil 3D).Reactome yolu veritabanı kullanılarak IFNa tedavisine yanıt olarak üç kattan fazla zenginleştirilmiş proteinlere yönelik yolların analizi, MHC-I aracılı antijen sunumunun ve işlenmesinin en baskın yol olduğunu gösterdi (Şekil 3E).Daha önceki raporlarla tutarlı olarak, OAS ve ISG15'in aracılık ettiği antiviral tepkilerin yanı sıra IFNa/β ve sitokin sinyallemesi aktive edilen yollar arasındaydı.Ek olarak, orijinal olarak elde edilen MS/MS spektrumlarından SIM-XL kullanılarak lizin ve serine spesifik protein çapraz bağlantıları tanımlandı.Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, 5 hücre tipinde bireysel ISG aşırı ekspresyonu çalışmalarının meta-analizi yoluyla 9 virüs sınıfından 20 virüsü kapsayan 104 ISG rapor edilmiştir9.Bununla birlikte, büyük veri kümelerinin taranmasının hesaplama sınırlamalarının üstesinden gelmek için, çoğu ISG olan, Padaria ve diğerleri tarafından bildirilen IRDS genleri listesi arasındaki olası etkileşimleri araştırmak üzere daha küçük bir veri kümesiyle başladık.
IFNa'ya yanıt olarak diferansiyel olarak eksprese edilen çapraz bağlı proteinlerin tanımlanması (Veriler MaxQuant'tan elde edilmiştir).(A) IFNa14 ile işlenmiş ve işlenmemiş Flo-1 örneklerinde tanımlanan ortak ve özel peptitlerin sayısını temsil eden Venn diyagramı.Muamele edilmemiş (B) ve IFNa ile muamele edilmiş (C) çapraz bağlı numunelerin peptid uzunluğu dağılımı.(D) Tedavi edilmemiş ve IFNa14 ile tedavi edilmiş Flo-1 hücreleri arasındaki log2'yi (LFQ yoğunluğunu) temsil eden ısı haritası.Sol panel, IFNa varlığında en aktif şekilde aktive edilen proteinleri gösterir.(E) IFNa tedavisinden sonra 20 ana zenginleşme yolunu temsil eden histogram.Reactome yolu veritabanı, yukarı regüle edilmiş IFNa'ya yanıt veren proteinlerdeki dört kattan fazla değişikliği analiz etti.
İnterferon aracılı ISG stimülasyonu iyi bir şekilde belgelenmiştir, ancak moleküler düzeyde bu proteinlerin çok çeşitli biyolojik fonksiyonlara nasıl ulaştığı tam olarak anlaşılamamıştır.Bilinen ISG'ler arasındaki protein etkileşimlerini yüksek derecede güvenle araştırdık.İlginç bir şekilde, IFNa tedavisine yanıt olarak büyük bir kompleks oluşturan MX1, USP18, ROBO1, OAS3 ve STAT1 proteinlerini içeren bir ağ belirledik (Şekil 4, Tablo S2)32,33,34.En önemlisi, bu etkileşimler IFNa ile tedavi edilen tüm üç kopyada bulundu ve işlenmemiş numunelerde bulunamadı; bu da bunların özellikle IFNa tedavisine yanıt olarak oluşturulduğunu düşündürüyor.STAT1'in bu ISG'lerin ekspresyonunu transkripsiyonel olarak düzenlediği bilinmektedir ancak bunun ISG'lerle protein düzeyindeki etkileşimi araştırılmamıştır.STAT1'in kristal yapısı, sarmal alanının (CCD), dimerlerin oluşumu sırasında DNA veya protomerlerle etkileşime dahil olmadığını gösterdi35.Bu a-helisler, etkileşimlerin oluşması için ağırlıklı olarak hidrofilik bir yüzey alanı sağlayan sarmal bir sarmal yapı oluşturur35.CLMS verilerimizde, STAT1 ile etkileşimlerin çoğunun CCD'den, bağlayıcı alandan veya C-terminal kuyruğundan (kalıntılar 700-708) (Şekil 4A) önceki SH2 alanında meydana geldiğini gözlemledik.Önceki bir çalışma, USP18'in STAT2'nin CCD'sine ve DNA bağlama alanına (DBD) bağlandığını ve tip I interferon sinyallemesinin inhibisyonuna aracılık etmek için tip I interferon reseptörü IFNAR2'nin alt birimine alındığını bildirmiştir24.Verilerimiz ayrıca USP18 katalitik alanının STAT1 DBD (Şekil 4A,D) ile etkileşime girdiğini gösterdi; bu, hem STAT1 hem de STAT2'nin USP18'i IFNAR2'ye çekmede rol oynayabileceğini öne sürüyor.
IFNa ile tedavi edilen çapraz bağlı hücrelerde tanımlanan protein-protein ISG ağı.(A) Moleküller arası etkileşimleri temsil eden çizgilerle (çapraz bağlantı kesme noktası 3,5'e ayarlanmıştır) protein-protein etkileşimlerini (SIM-XL programında oluşturulan) gösteren 2 boyutlu etkileşim grafiği.Farklı kimliklere sahip alanlar renkleriyle işaretlenir32: MX1 alanı, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) ve GED (569–660).OAS3 alanları: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) ve OAS1_C (903-108).Etki alanı ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ve fn3 (777–864).STAT1 alanları: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) ve STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Sırasıyla mavi ve kırmızı ile etiketlenmiş etkileşimler ve etkileşimler ile çapraz bağlı proteinlerin (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 ve STAT1) dairesel görüntüleyicisi.Çapraz bağlantı eşiği 3,5 olarak ayarlandı.Nokta grafikleri, MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) ve OAS3 (F) ile STAT1 etkileşim bölgelerini ve ayrıca iki peptid arasındaki K veya S etkileşim bölgelerini gösterir.Şekilde çapraz bağlantı puanı eşiği 3,0 olarak ayarlanmıştır.(G) PyMol'deki (PyMOL moleküler grafik sistemi, versiyon 2.0 Schrödinger, LLC.) protein yapıları üzerine bindirilmiş STAT1 ve OAS3 DI alanları arasındaki çeşitli etkileşim bölgeleri;STAT1 (pdb kimliği: 1bf533) ve OAS3 (pdb kimliği: 4s3n34).) programı.
USP18'in iki izoformu insanlarda tanımlanmıştır; ağırlıklı olarak çekirdekte bulunan tam uzunlukta bir protein ve sitoplazmada ve çekirdekte eşit olarak dağıtılan, N-terminal alanı olmayan bir izoform olan USP18-sf36.Ek olarak, N-terminalinin yapılandırılmamış olduğu ve izopeptidaz aktivitesi veya ISG1537 bağlanması gerektirmediği tahmin edilmiştir.Çalışmamızda tanımlanan etkileşimlerin çoğu, proteinin N-terminalinde yer alıyordu; bu, bu etkileşimlerin tam uzunlukta USP18'i (Şekil 4A,D) içerdiğini ve dolayısıyla muhtemelen çekirdekte meydana geldiğini öne sürüyor.Dahası, verilerimiz aynı zamanda N terminalinin protein-protein etkileşimleri için uzmanlaşmış olduğunu da göstermektedir.IFNAR2 bağlanma bölgesi, 312-368 kalıntıları arasında yer alır ve özellikle kompleksteki proteinlerin hiçbiri bu bölgeye bağlanmaz (Şekil 4A)37,38.Birlikte ele alınan bu veriler, IFNAR2 bağlanma alanının yalnızca reseptör proteini tarafından kullanıldığını gösterir.Ek olarak, yalnızca OAS3 ve ROBO1'in N terminalinin yukarısındaki alanlarla ve IFNAR2 bağlanma bölgesiyle ilişkili olduğu bulundu (Şekil 4A).
ROBO1, transmembran sinyal moleküllerinin immünoglobulin (Ig) süper ailesine aittir ve hücre dışı bölgede beş Ig alanından ve üç fibronektin (Fn) alanından oluşur.Bu hücre dışı alanları, membrana yakın bir bölge ve tek bir transmembran sarmalı (39) takip eder. Yapılandırılmamış bir hücre içi bölge, C terminalinde bulunur ve efektör protein bağlanmasına aracılık eden korunmuş dizi motifleri içerir39.~1100'den 1600'e kadar olan aminoasitlerden oluşan bölge çoğunlukla düzensizdir.MX1'in ROBO1 ile Ig, Fn ve hücre içi alanlar aracılığıyla etkileşime girdiğini, STAT1 ile etkileşimlerin çoğunun CCD, bağlayıcı alan ve ROBO1'in C terminali arasında gerçekleştiğini bulduk (Şekil 4A,E).Öte yandan DI, DIII ve OAS3 bağlayıcı bölgeleri ile etkileşimler ROBO1 proteini boyunca dağılmıştır (Şekil 4A).
Oligoadenilat sentaz (OAS) protein ailesi, hücre içi çift sarmallı RNA'yı (dsRNA) kabul eder ve bağlar, konformasyonel değişikliklere uğrar ve 2',5'-bağlı oligoadenilatları (2-5 As)40 sentezler.Üç OAS arasında OAS3'ün dsRNA için en yüksek afiniteyi sergilediği ve RNase L'yi aktive edebilen ve dolayısıyla viral replikasyonu41 sınırlayabilen en az miktarda 2-5 As sentezlediği bulunmuştur.OAS ailesi, polimeraz beta (pol-β) benzeri nükleotid transferaz alanlarından oluşur.Önceki araştırmalar, C-terminal alanının (DIII) katalitik aktivitesinin, OAS342'nin aktivasyonu için gerekli olan dsRNA bağlama alanına (DI) bağlı olduğunu göstermiştir.OAS3'ün DI ve DII alanlarının CCD ve SH2 ile STAT1 TAD arasındaki küçük bir bağlantı bölgesi ile etkileşime girdiğini gözlemledik(Şekil 4A,F).Protein yapısı üzerine farklı çapraz bağlanma bölgelerinin yerleştirilmesi, β-tabaka ve DBD STAT1 döngüsü ile OAS3'ün DI alanındaki 60-75 kalıntılarının oluşturduğu açık bir cep veya boşluk arasında bir etkileşimi ortaya çıkardı (Şekil 4G).Kompleksteki proteinlerin oryantasyonu ayrıca OAS3 ile etkileşimlerin hiçbirinin DI alanının DNA bağlama kabiliyetine müdahale etmediğini de gösterdi (Şekil S1A).Ek olarak GTPase MX1'in N-terminal alanı, OAS3'ün DI ve DIII alanlarıyla yoğun bir şekilde etkileşime girer (Şekil 4A).Ayrıca, IFNa ile tedavi edilen üç tekrarın hepsinde OAS1 ve MX1 arasında bir etkileşim gözlemledik; burada tek bir OAS1 alanı (ayrıca katalitik olarak aktif) üç MX1 alanıyla da etkileşime girdi (Şekil S2A,B).
MX proteinleri, GTP'yi bağlayan ve hidrolize eden bir N-terminal GTPaz alanı, kendi kendine birleşmeye aracılık eden bir ara alan ve bir GTPaz (LZ) olarak görev yapan bir C-terminal lösin fermuarı içeren geniş bir dynein benzeri GTPaz ailesinin parçasıdır. ).etki alanı efektör alanı25,43.MX1 viral genin transkripsiyonunu bloke etmek için viral polimerazların alt birimlerine bağlanır43.Daha önce bildirilen bir maya iki hibrit taraması, PIAS1 ile ilişkili MX1'in, DNA bağlama aktivitesini bloke ederek STAT1 aracılı gen aktivasyonunu inhibe ettiğini ve ayrıca SUMO E344,45 ligaz aktivitesine sahip olduğunu gösterdi.Burada, MX1'in STAT1'e bağlandığını gösteriyoruz (Şekil 4C,D), ancak bu etkileşimin IFNa'ya yanıt olarak STAT1 aracılı gen aktivasyonunu nasıl etkilediğinin daha fazla çalışmaya ihtiyacı var.Ek olarak, MX1'in IFNa ile tedavi edilen üç tekrarın hepsinde IFIT3 ve DDX60 ile etkileşime girdiğini de bulduk (Şekil S2C).
DDX60, daha önce viral RNA46'nın RIG-I'den bağımsız bozulmasında rol oynadığı bildirilen IFN'nin neden olduğu bir sitoplazmik helikazdır.RIG-I ile etkileşime girer ve sinyalleşmesini liganda özgü bir şekilde etkinleştirir46. DDX60, bir DEXD/H-Box helikaz alanından ve viral RNA ve DNA'yı bağlayan bir C-terminal helikaz alanından oluşur47.MX1 ve IFIT3 ile etkileşimlerinin çoğu, kanonik alanlar veya motifler olmadan uzun N ve C terminal bölgelerinde meydana gelir (Şekil S2E, F).Bununla birlikte MX1 aynı zamanda DEXD/H-Box helikaz alanıyla da ilişkilidir (Şekil S2E).IFIT ailesinin proteinleri, tetrapeptit tekrarı (TPR) adı verilen kendine özgü bir sarmal-dönüş-sarmal motifinin tandem kopyalarına sahiptir.IFIT3'ün, RIG-I sinyallemesinin pozitif bir modülatörü olduğu ve dolayısıyla MAVS kompleksinin bir bileşeni olduğu bulundu.Birlikte ele alındığında, verilerimiz IFIT3 ve DDX60'ın öncelikle IFIT3'ün TPR 3-6 arasındaki bölgede etkileşime girdiğini ve RIG-I / MAVS sinyallemesinde rol oynayabileceğini göstermektedir (Şekil S2F).
Tüm proteomun taranmasının hesaplama açısından yoğun olduğu göz önüne alındığında, daha sonra tüm insan UniProt veritabanını IFNa ile tedavi edilen tekrarlardan birinin varlığı açısından taradık.Bu kopyada HLA-A için oldukça güvenilir birkaç etkileşim ağı bulduk.MS/MS spektrumları tarafından tanımlanan protein yollarının analizi, MHC-I bazlı antijen işleme ve sunumunun, interferon tarafından indüklenen ana yol olduğunu gösterdi (Şekil 3D).Bu nedenle, tüm çapraz bağlı numunelerde MHC-I moleküllerinin protein etkileşimlerini yüksek derecede güvenle incelemeye odaklandık.HLA, α1, α2 ve α3 alanlarından ve hafif zincirlerden oluşur ve mikroglobulin β2 (β2m), sabit bir şaperon proteinidir49.HLA, endoplazmik retikulumda bir kez toplandıktan sonra peptid ligandlarının yokluğunda kararsızdır50.Peptid bağlama oluğu, peptit olmayan formdaki yüksek düzeyde polimorfik ve yapılandırılmamış a1 ve a2 alanları ve nispeten daha az polimorfik a351 alanı tarafından oluşturulur.IFNa varlığında iki HLA-A kompleksi tespit ettik: biri HMGA1 ve H2B ile etkileşime girer (Şekil 5, Tablo S3), diğeri ise MDN1, LRCH4 ve H2B ile etkileşime girer (Şekil 6).
IFNa, H2B (H2BFS) ve HMGA1 ile bir HLA-A etkileşim ağını indükler.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksindeki farklı etkileşim türlerini gösteren 2 boyutlu çizim (SIM-XL yazılımında oluşturulmuştur): ara bağlantı (mavi), ara bağlantı (kırmızı) ve tek bağlantı (siyah)..Farklı kimliklere sahip alanlar renk kodludur32: H2B (histon; 2–102) ve MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 ve MHC_I_C; 337–364).Çapraz bağlantı eşiği 3,5 olarak ayarlandı.Nokta grafikleri, H2B (B) ve HMGA1 (C) ile HLA-A etkileşim bölgelerini ve ayrıca iki peptit arasındaki K veya S etkileşim bölgelerini gösterir.Şekilde çapraz bağlantı puanı eşiği 3,0 olarak ayarlanmıştır.(D) PyMOL programında H2B, HLA-A ve HMGA1 proteinlerinin yapılarında gösterilen proteinler arasındaki ilişkiler.Bu yapılar Phyre2 sunucusu (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) kullanılarak modellenmiştir ve H2B, HLA-A ve HMGA1 proteinleri için şablon yapılar sırasıyla 1kx552, 1kj349 ve 2eze55'tir.
IFNa, H2B (H2BFS), MDN1 ve LRCH4 ile bir HLA-A etkileşim ağını indükler.(A) MDN1'in bir daire olarak temsil edildiği 2 boyutlu etkileşimli bir haritada (SIM-XL yazılımında oluşturulan) sunulan molekül içi (kırmızı) ve moleküller arası (mavi) çapraz bağlantılar.Çapraz bağlantı eşiği 3,5 olarak ayarlandı.Farklı kimliklere sahip alanlar renk kodludur32: H2B (histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 ve MHC_I_C; 337–364) ve LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ve CH (535–641)).(B) PyMOL programında H2B, HLA-A, LRCH4 ve MDN1 proteinlerinin yapılarında gösterilen proteinler arasındaki ilişkiler.Bu yapılar, H2B, HLA-A, LRCH4 ve MDN1 proteinleri için 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ve 6i2665 şablon yapılarına sahip Phyre2 sunucusu (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) kullanılarak modellendi, sırasıyla.H2B (C), LRCH4 (D) ve MDN1 (E) ile HLA-A için K veya S etkileşim bölgelerini gösteren nokta grafikleri.Grafikler için çapraz bağlantı puanı eşiği 3,0 olarak ayarlandı.
Histon H2B, genomun bütünlüğünü korumanın yanı sıra, transkripsiyonun düzenlenmesinde de rol oynar.H2B proteini, ilmeklerle ayrılmış üç a-helis ve bir C-terminal kuyruğundan (41,52) oluşan merkezi bir histon alanından (HFD) oluşur.H2B ile etkileşimin çoğu, HFD heterodimeri ile trimerizasyon sağlayan α1 sarmalında meydana gelir (Şekil 5A,B).Lizinler DNA bağlanmasında yer almasına rağmen, bazı lizinler aynı zamanda alternatif asetilasyon veya metilasyon bölgeleridir.Örneğin, H2B'den gelen K43, K46 ve K57 kalıntıları doğrudan DNA bağlanmasına dahil değildir, ancak çeşitli transkripsiyon sonrası modifikasyonların hedefleridir53.Benzer şekilde H2B'deki K44, K47 ve K57 kalıntıları, diğer proteinlerle etkileşimler de dahil olmak üzere IFNa varlığında alternatif bir rol oynayabilir (Şekil 5A, B).Ek olarak kromozom dışı histon H2B, çeşitli hücre tiplerinde bağışıklık tepkisini etkinleştirir ve bulaşıcı ajanlardan veya hasarlı hücrelerden türetilen çift sarmallı DNA (dsDNA) parçalarını tespit etmek için sitozolik bir sensör görevi görür54.DNA virüslerinin varlığında H2B tükenmesi, IFN-β üretimini ve STAT154 fosforilasyonunu inhibe etti.H2B'nin çekirdeğe diğer çekirdek histonlardan daha hızlı girip çıktığı da bilinmektedir54.Seçilen işlenmemiş örneklerde MDN1 ve LRCH4 ile H2B etkileşimleri de gözlendi.HLA-A'nın, IFNa ile tedavi edilen üç numunenin tamamında ve tedavi edilmemiş bir tekrar numunesinde H2B ile etkileşime girdiğini bulduk.Bu veriler H2B'nin transkripsiyonel düzenlemeden bağımsız alternatif bir fizyolojik fonksiyondaki rolünü yansıtmaktadır.
Hastalığı teşvik eden amino asitler açısından zengin küçük bir nükleoprotein olan HMGA1'in (yüksek mobilite grubu AT-Hook 1), HLA-A ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir.Asidik bir C-terminali kuyruğuna ve AT kancaları adı verilen üç farklı DBD'ye sahiptir çünkü bunlar dsDNA55,56'daki AT açısından zengin bölgenin küçük oluğuna bağlanır.Bu bağlanma, DNA'nın bükülmesine veya düzleşmesine neden olarak kanonik transkripsiyon faktörlerinin kendi konsensüs dizisine erişmesine izin verir.C-terminal delesyon mutantları transkripsiyonu başlatamadığından, C-terminal kuyruğunun protein-protein etkileşimlerinde ve transkripsiyon faktörlerinin toplanmasında rol oynadığına inanılmaktadır57.Ayrıca bu alan, kinazlar 58 için bilinen substratlar olan birçok korunmuş fosforilasyon bölgesini içerir.C-terminal alanı dışında HMGA1 ile HLA-A ve H2B etkileşimlerini gözlemledik; bu, C-terminal alanının esas olarak transkripsiyon faktörü bağlanması için kullanıldığını ortaya koyuyor (Şekil 5A, C).HMGA proteinleri adaptör DNA'ya bağlanmak için histon H1 ile rekabet eder, böylece erişilebilirliği arttırır57.Benzer şekilde, HMGA'nın histon H1 ile rekabet halinde bağlayıcı DNA boyunca histon H2B ile etkileşime girmesi muhtemel görünüyor.HMGB1, dendritik hücrelerde HLA-A, -B ve -C ekspresyonunu indükleyerek bunların aktivasyonuna yol açar59, ancak HMG ile HLA arasında bir etkileşim daha önce bildirilmemiştir.HMGA1'in HLA-A'nın α1 ve α3 alanlarıyla etkileşime girdiğini ve etkileşimlerin çoğunun 3 DBD'nin dışında olduğunu bulduk (Şekil 5A,C).Elimizde, HLA-A'nın çekirdekte lokalize olduğu bulundu (veriler gösterilmemiştir) ve H2B ve HMGA1'in de çekirdekte mevcut olduğu göz önüne alındığında, bu etkileşimin muhtemelen çekirdekte meydana geldiği görülmektedir.H2B, HLA-A ve HMGA1 arasında ölçülen spesifik eklentiler Şekil 5D'de gösterilmektedir.
HLA-A'nın diğer proteinlerle çoğu etkileşimi, onun α1 ve α2 alanlarında ve düzensiz C-terminal alanında meydana gelir (Şekil 6).Bu örneklerden birinde HLA-A'nın LRCH4'ün düzensiz N-terminal kuyruğu ile etkileşime girdiğini bulduk (Şekil 6A,D).LRCH4, TLR4 aktivasyonunu ve LPS sitokin indüksiyonunu düzenleyerek doğuştan gelen bağışıklık tepkisini modüle eder60,61.Dokuz lösin açısından zengin tekrara (LRR'ler) ve ektodomain'inde bir kalmodulin (CH) homoloji motifine ve ardından bir transmembran alan (TMD) 60, 62'ye sahip bir membran proteinidir.CH alanlarının protein-protein etkileşimlerine aracılık ettiği rapor edilmiştir60.LRR ve CH alanları arasındaki yaklaşık 300 amino asitlik bir kısım nispeten erişilebilirdir ancak düzensizdir.Düzensiz bölgelerin, protein-protein ağları ve veziküler taşımanın aracıları olarak işlevine dayanarak, çoğu protein etkileşiminin düzensiz bölgelerde meydana geldiğini bulduk.MDN1 ile etkileşimler, LRR1, LRR6, CH alanları ve rastgele bölgeler de dahil olmak üzere proteinin uzunluğu boyunca dağıtılırken H2B esas olarak CH alanına bağlandı (Şekil 6A, B).Özellikle etkileşimlerin hiçbiri TMJ'yi içermiyordu, bu da CLMS yaklaşımının özgüllüğünü ortaya koyuyor (Şekil 6A, B).
MDN1 ayrıca HLA-A protein ağının bir parçası olarak da tanımlanmıştır (Şekil 6A).AAA protein ailesine (farklı aktivitelerle ilişkili ATPazlar) aittir.Bu, hekzamerik bir halka halinde organize olan ve 60S 64 ribozomal alt biriminden montaj faktörünü ortadan kaldıran aynı N-terminal AAA alanıdır.dynein64,65,66'ya benzer görünüyor.Ek olarak Asp/Glu açısından zengin bölgeyi MIDAS alanı (metal iyonuna bağımlı bölge) takip eder.MDN1'in büyük boyutu (yaklaşık 5600 amino asit) ve iyi çalışılmış proteinlerle sınırlı homolojisi nedeniyle, insanlardaki yapısı ve işlevi hakkında çok az şey bilinmektedir.HLA-A, H2B ve LRCH4'ü MDN1 bağlanma ortakları olarak tanımladık ve bunların PyMol'de protein kompleksleri olarak yönelimlerini ortaya çıkardık (Şekil 6A,B).Bu üç protein, AAA alanı, dynein benzeri bağlayıcı alan ve muhtemelen MIDAS MDN1 alanı ile etkileşime girer.Önceki bir raporda, yem proteinlerinin afinite saflaştırması, MDN1'i histon H2B67 ile ilişkili bir protein olarak tanımladı.Ek olarak yakın zamanda yapılan bir çalışmada, afiniteyle saflaştırılmış kütle spektrometresi kullanılarak HCT116 hücrelerinde MDN ile HLA-B arasında bir etkileşim olduğu rapor edildi ve bulgularımız desteklendi68.Bu kompleksin IFNa ile tedavi edilen numunelerde tanımlanması, MDN1'in interferon sinyallemesinde bir rol oynadığını düşündürmektedir.
HLA genleri oldukça polimorfik olduğundan, Flo-1 hücrelerinin RNA dizileme verilerinden HLA-A, -B ve -C haritalama okuma dizilimini çıkardık (veriler gösterilmemiştir).Sıralama okumasıyla tutarlı peptit sekansları, HLA-A'da çapraz bağlı peptitlerin bulunduğu bölgelerde HLA-A, -B ve -C arasında önemli farklılıklar ortaya çıkardı (Şekil S3).Ayrıca HLA-B/C moleküllerinin H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 proteinleri ile proteinden proteine ​​çapraz bağlandığını gözlemlemedik.Bu, HLA-A, MDN1, LRCH1 ve HMGA1 arasında bulunan protein etkileşiminin HLA-A'ya spesifik olduğunu göstermektedir.Ek olarak çapraz bağlanmamış numunelerin proteomik analizi (Tablo S4), HLA-A'nın HLA-B veya HLA-C'ye kıyasla daha yüksek dizi kapsamına sahip olduğunu gösterdi.HLA-A için tanımlanan peptitlerin yoğunluğu hem IFNa ile tedavi edilen hem de tedavi edilmeyen numunelerde yüksekti.
Burada tanımlanan etkileşimlerin, yakın uzaysal yakınlıkta iki proteinin spesifik olmayan çapraz bağlanmasından kaynaklanmadığından emin olmak için, ortak immünopresipitasyon analizleri gerçekleştirerek iki yeni HLA-A etkileşimli faktörünü de doğruladık.Hem IFNa ile tedavi edilen hem de tedavi edilmeyen Flo-1 hücrelerinde endojen MDN1 ve H2B ile HLA-A etkileşimleri tespit edildi (Şekil 7, Şekil S4).HLA-A'nın immünopresipitatlarda H2B tarafından yakalandığını ve işlenmemiş hücrelerden alınan immünopresipitat örneklerinde HLA-A bulunmadığından bu ilişkinin IFNa tedavisinden kaynaklandığını doğruladık (Şekil 7A).Ancak verilerimiz IFNa'nın HLA-A'nın H2B ve MDN1'e bağlanmasını farklı şekilde düzenlediğini göstermektedir.IFNa, H2B ile HLA-A arasındaki ilişkiyi indükler, ancak bunun MDN1 ile ilişkisini azaltır.MDN1'in kontrollerde HLA-A ile ilişkili olduğunu ve IFNa eklenmesinin, IFNa tarafından MDN1 indüksiyonundan bağımsız olarak bu etkileşimi azalttığını bulduk (Şekil 7B,C).Ek olarak, HLA-A immünopresipitasyonu, A549 hücrelerinde H2B'yi yakaladı (Şekil S4), bu etkileşimin hücre tipinden bağımsız olduğunu ortaya koyuyor.Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, HLA-A'nın H2B ve MDN1 ile interferon aracılı etkileşimlerini desteklemektedir.
HLA-A, H2B ve MDN1'i birlikte saflaştırır.Temsilci endojen H2B (A) ve MDN1 (B) immünoblotları, IFNa ile tedavi edilen Flo-1 hücrelerinden immüno-çökeltildi ve belirtilen antikorlar açısından problandı.Negatif kontrol olarak fare ve tavşan IgG'si kullanıldı.(C) Farklı antijenlerin nispi miktarları (girdi), belirtilen antikorlara karşı incelenen immünoblotlarla gösterilir, yükleme kontrolü olarak β-aktin kullanıldı.
İnterferon kaynaklı son derece güvenilir çapraz bağlı ağlardan biri olan H2B-HLA-A-HMGA1'in yapısal özellikleri araştırıldı.Bu komplekste yer alan proteinlerin konformasyonel dinamiklerini anlamak için alternatif bir yaklaşım olarak moleküler dinamik modellemeyi kullandık (Şekil 8).CLMS verilerinden elde edilen çıkarımlar, H2B, HLA-A ve HMGA1 proteinlerinin farklı konformasyonlarının olasılığını ortaya koymaktadır.Bu nedenle aşağıdaki potansiyel kompleksler bir solvent ortamında modellendi: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A ve H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paketini kullanan bir başlangıç ​​protein-protein yerleştirme taraması, bu proteinler arasında farklılık gösteren olası konformasyonları önerdi (Şekil 8A).Yerleştirme protein kompleksinin görselleştirilmesi çeşitli etkileşimleri ve olası konformasyonları ortaya çıkardı (Şekil 5A, 8).Bu nedenle, olası bir konformasyon Şekil 8A'da (etiketli çapraz bağlantılar ile) gösterilmiştir ve MD modelleme boru hattı kullanılarak daha da değerlendirilmiştir.Ayrıca H2B veya HMGA1'in HLA-A'ya bağlanması, H2B'nin HLA-A'ya olan yüksek afinitesini vurgular (Şekil 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A ve H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksleri arasındaki olası ağların konformasyonel dinamikleri.(A) Sol panel, molekül içi (kırmızı) ve moleküller arası (mavi) çapraz bağlantıların (çapraz bağlantı kesme değeri 3,5'e ayarlanmış) 2 boyutlu bir haritasıdır (SIM-XL yazılımında oluşturulmuştur).Ayrıca belirlenen çapraz bağlanma kalıntıları H2B, HLA-A ve HMGA1 proteinlerinin yapıları üzerinde etiketlenir.Bu proteinlerin ilişkili konformasyonları, MOE paketinde uygulanan yerleştirme boru hattı kullanılarak çıkarıldı.Sol alt panel, H2B-HLA-A ve HMGA1-HLA-A komplekslerinin farklı protein-protein bağlanma afinitelerine (GBVI/WSA dG; kcal/mol) sahip çeşitli olası konformasyonlarını gösterir.(B) Her protein yapısı için atomik konumların (hidrojen atomları hariç) standart sapması (RMSD).(C) ≥ 10 ns süreli spesifik etkileşimler dikkate alınarak çeşitli simüle edilmiş komplekslerden moleküller arası protein-protein hidrojen bağı etkileşimleri.H-bağı donör-alıcı kesme mesafesi 3,5 Å'ye ayarlandı ve donör-H-alıcı kesme açısı ≥ 160°-180°'ye ayarlandı.(D) Sahte HLA-A-H2B ve HLA-A-HMGA1 komplekslerinden ekstrakte edilmiş, ≥ 20 ns'yi kapsayan, ilgili ortaklarıyla HLA-A protein-protein etkileşimleri oluşturan etiketli kalıntılar.Protein yapıları, 100 ns'lik MDS'nin ortalama yapısını temsil eder.(E) HLA-A-H2B ve HLA-A-HMGA1 kompleksleri arasındaki etkileşimler, iki peptit arasındaki K veya S etkileşim bölgesine dayalı olarak 100 ns boyunca H2B-HLA simülasyonu ile izlenen etkileşimlerle karşılaştırıldığında.Kompleksler /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Çapraz bağlantıların değerlendirilmesine yönelik eşik değeri 3,0'a ayarlandı ve MDS'den ≥ 10 ns süren spesifik etkileşimler dikkate alındı.Protein yapıları, BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, ABD) ve Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paketleri kullanılarak görselleştirildi.
HLA-A moleküllerinin zaman içindeki stabilitesi (standart sapma; RMSD veya standart sapma; RMSF), komplekslerdeki H2B veya HMGA1 proteinlerinin varlığının HLA-A'yı stabilize ettiğini gösterdi (Şekil 8B, Şekil S5).HMGA1 proteini, HLA-A'nın B2M bölgesine sıkı bir şekilde bağlanarak HLA-A-HMGA1 veya H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksindeki HLA-A amino asitlerinin stabilitesini indükler (Şekil 8B, Şekil S5).özellikle ~60-90 ve ~180-210 HLA kalıntılarının H2B varlığında daha az esnek olduğu bulunmuştur (Şekil 8B).H2B ve HMGA1, HLA-A'nın tek başına H2B veya HMGA1'e bağlanmasına kıyasla H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksinde HLA-A'ya daha iyi bağlanma gösterdi (Şekil 8C,D; Tablo S5).Hidrojen bağlanmasında yer alan kalıntılar (MD modelli yüksek doluluk ≥ 10 ns), kompleksteki CLMS etkileşim bölgeleriyle (K veya S kalıntıları) çakışır; bu, CLMS tarafından tanımlanan etkileşimlerin çok güvenilir olduğunu gösterir.Güvenilirlik (Şekil 8E).CLMS ve MD modellemesinde yaklaşık 190-210 ve yaklaşık 200-220 amino asit arasındaki HLA-A kalıntılarının sırasıyla H2B ve HMGA1'i bağladığı bulunmuştur (ŞEKİL 8E).
Protein-protein etkileşimleri, belirli uyaranlara yanıt olarak hücre içi iletişime aracılık eden dinamik yapısal ağlar oluşturur.Birçok proteomik yaklaşım, bir proteinin genel kararlı durum seviyesindeki değişiklikleri tespit ettiğinden, protein-protein etkileşim dinamikleri, bağlanma arayüzlerini yakalamak için ek araçlar gerektirir ve CLMS de böyle bir araçtır.İnterferon sinyal sistemi, hücrelerin bir dizi çevresel patojenik ve içsel patolojik sinyale yanıt vermesine olanak tanıyan ve interferonla indüklenebilir proteinlerin alt kümelerinin indüksiyonuyla sonuçlanan bir sitokin ağıdır.İnterferon kaynaklı proteinlerden oluşan bir panel arasında yeni protein-protein etkileşimlerinin tanımlanıp tanımlanamayacağını belirlemek için CLMS'yi uyguladık.Protein komplekslerini yakalamak için interferona duyarlı Flo-1 hücre modelinde global protein çapraz bağlanma analizi kullanıldı.Triptik peptitlerin çapraz bağlı olmayan ve çapraz bağlı hücrelerden ekstraksiyonu, tanımlanmış LFQ yoğunluğu ile peptit sayımına, yol zenginleştirmesine ve peptit uzunluğu dağılımına olanak tanır.Kanonik interferonla indüklenebilir proteinler, pozitif bir iç kontrol olarak tanımlanırken, MX1, UP18, OAS3 ve STAT1 gibi kanonik interferonla indüklenebilir proteinlerin yeni moleküller arası ve moleküller arası çapraz bağlı eklentileri gözlemlendi.Çeşitli yapısal özellikler ve fonksiyonel alanlardaki etkileşimler araştırılmıştır.
HLA-A, MDN1 ve H2B arasındaki bir etkileşim, IFNa ile tedavi edilen ve edilmeyen Flo-1 ve A549 hücrelerinde immünoblotlama yoluyla tespit edildi.Sonuçlarımız HLA-A'nın H2B ile IFNa'ya bağımlı bir şekilde kompleksleştiğini vurgulamaktadır.Çalışmamız bu iki kompleksin ortak lokalizasyonunun daha fazla araştırılması için ilginç bir yolu temsil ediyor.Hücre türünden bağımsız interferon aracılı protein etkileşimlerini tanımlamak için CLMS yaklaşımını bir hücre çizgileri paneline genişletmek de ilginç olacaktır.Son olarak, molekül içi ve moleküller arası çapraz konuşmaları izleyen H2BFS-HLA-A-HMGA1 kompleksinde yer alan proteinlerin konformasyonel dinamiklerini anlamak için alternatif bir yaklaşım olarak MD modellemeyi kullandık.CLMS verilerinden elde edilen çıkarımlar, H2BFS, HLA-A ve HMGA1 proteinlerinin farklı konformasyonlarının olasılığını ortaya koymaktadır.Bu kenetlenme proteini kompleksleri arasındaki olası farklı konformasyonlar, CLMS veri setinde gözlemlenenlere benzer çeşitli etkileşimleri ortaya çıkardı.Yöntemimizin temel güçlü yanlarından biri, HLA gibi etkileşim halindeki yüksek oranda polimorfik genlerin kolay tanımlanmasına izin vermesidir, dolayısıyla başka türlü incelenmesi zor olan HLA haplotipine özgü proteinlerin etkileşimlerini incelemek ilginç olacaktır.Birlikte ele alındığında, verilerimiz CLMS'nin interferon kaynaklı sinyal ağları hakkındaki anlayışımızı genişletmek ve tümör mikroçevresindeki daha karmaşık hücrelerarası sistemleri incelemek için bir temel sağlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.
Flo-1 hücreleri ATCC'den elde edildi ve %1 penisilin/streptomisin (Invitrogen), %10 fetal sığır serumu (Gibco) ile desteklenmiş DMEM'de (Gibco) muhafaza edildi ve 37°C ve %5 C02'de saklandı.Kuluçka.Hücreler, IFNa14 (Edinburgh Protein Üretim Tesisi tarafından üretilmiştir) ile işleme tabi tutulmadan önce %70-80 birleşme noktasına kadar büyütüldü.Diğer tüm kimyasallar ve reaktifler, aksi belirtilmediği sürece Sigma Aldrich'ten satın alınmıştır.
Flo-1 hücreleri 6 oyuklu plakalarda kültürlendi ve ertesi gün hücreler, yaklaşık %80 birleşme noktasına kadar 24 saat boyunca 10 ng/ml IFNa14 ile işlendi.Hücreler üç kez PBS ile yıkandı ve 5 dakika boyunca 37°C'de PBS içerisinde taze hazırlanmış DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO içerisinde çözündürülmüş) ile 0.5 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar bağlandı.DSS çapraz bağlama reaksiyonu, PBS ile değiştirildi ve artık DSS, 37°C'de 15 dakika boyunca PBS içerisinde 20 mM Tris (pH 8.0) ilave edilerek söndürüldü.Hücreler kazınarak toplandı ve düşük bağlayıcı tüplerde (Aksijen) toplandı.
Hücre topağı, 300 ul üre lizis tamponu (8 M üre, 0.1 M Tris, pH 8.5) ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ara sıra çalkalanarak lize edildi.Tüm santrifüjleme adımları 14.000 xg'de 8°C'de gerçekleştirildi.Lizatı 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.Geri kalan berrak parçacıklar, homojen bir sulu çözelti elde edilene kadar 30 dakika veya daha uzun bir süre boyunca 150 ul ikinci lizis tamponunda (2 M üre, %2 (a/h) SDS (sodyum dodesil sülfat)) çözündürüldü.Lizat 20 dakika boyunca santrifüjlendi ve süpernatan, önceki adımda elde edilen lizat ile karıştırıldı.Protein konsantrasyonları, üreticinin mikroplaka prosedürlerine ilişkin talimatlarına göre Mikro BCA tahlili (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak değerlendirildi.Numuneler hızlı bir şekilde sıvı nitrojen içerisinde donduruldu ve -80°C'de saklandı.
Yaklaşık 100 µg çözünür çapraz bağlı protein, Wisniewski ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi değiştirilmiş bir filtrasyon numunesi hazırlama protokolü (FASP) kullanılarak işlendi.69 Kısaca protein, 200 ul üre tamponu (0,1 M Tris içinde 8 M üre, pH 8,5) ile çapraz bağlanır, vortekslenir ve yarıya bölünür.Tüm santrifüjleme adımları 25°C'de 14.000 xg'de gerçekleştirildi.Çapraz bağlı protein lizatının ilk yarısı, bir Ultracel-10 membran (Merck) ile donatılmış bir 10 kDa Microcon santrifüj filtre cihazına aktarıldı, ardından filtre üzerinde 25 dakika santrifüj edildi.Daha sonra proteinin ikinci yarısını filtreye ekleyin ve aynı adımları tekrarlayın.Üre tamponu içerisine 100 ul 17 mM tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP) eklenerek protein geri kazanımı gerçekleştirildi.Geri kazanım, bir termomikser üzerinde 600 rpm'de 30 dakika boyunca 37°C'de karıştırıldı.Ek olarak kolon santrifüjlendi ve indirgenmiş çapraz bağlı protein, üre tamponu içerisinde 100 ul 50 mM iyodoasetamid kullanılarak alkile edildi.Alkilasyon reaksiyonu oda sıcaklığında 20 dakika karanlıkta gerçekleştirildi.Kolonu döndürün, kolon duvarlarını 3 kez 100 µl üre tamponuyla yıkayın ve ardından santrifüjleyin.Aynı işlem 100 ul 100 mM amonyum bikarbonat kullanılarak 3 kez gerçekleştirildi.Tripsinizasyondan önce toplama tüpünü yenisiyle değiştirin.Tripsin tamponu (Promega) içerisinde seyreltilmiş 50 mM amonyum bikarbonat ve 1 ul trypsin içeren sindirim tamponu ekleyin.Tripsinin proteine ​​oranı yaklaşık 1:33'te tutuldu ve sindirim reaksiyonları nemli bir odada 37°C'de gece boyunca inkübe edildi.Çapraz bağlı peptit, 25 dakika boyunca santrifüjleme yoluyla filtreden elüt edildi.Filtreye 50 ul 0,5 M NaCl eklenmesi ve ardından 25 dakika santrifüj edilmesiyle peptid geri kazanımı iyileştirildi.
C18 Micro Spin kolonları (Harvard Apparatus), küçük değişikliklerle Bouchal ve diğerleri70 tarafından açıklanan protokolü takip ederek çapraz bağlı triptik peptitlerin tuzunu gidermek için kullanıldı.Kısaca, C18 döndürme kolonları, asetonitril (AcN) (Merck) içindeki %0,1 formik asit (FA) ile üç yıkama ve %0,1 FA ile iki yıkama ile aktive edildi.Kolon 15 dakika boyunca %0,1 FA ile hidratlandı.Numuneleri döndürme kolonlarına yükleyin ve %0,1 FA ile 3 kez yıkayın.Tuzu giderilen peptitler, %0,1 FA içerisinde %50, %80 ve %100 AcN kullanılarak adım adım bir gradyanla sırayla elüe edildi.Numuneler, kalan sıvı tamamen yok olana kadar bir SpeedVac Plus yoğunlaştırıcıda (Eppendorf) kurutuldu.Yıkanan peptitler, %2,5 AcN içindeki 100 ul %0,08 trifloroasetik asit içerisinde çözüldü ve konsantrasyonlar bir NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) üzerinde ölçüldü.Numune başına yaklaşık 1 µg çapraz bağlı peptit, LC-MS/MS sistemine enjekte edildi.
Çapraz bağlı peptitler, bir Orbitrap Exploris 480 kütle spektrometresine (Thermo Scientific) bağlı bir UltiMate 3000 RSLCnano LC sistemi (Thermo Scientific) üzerinde ayrıldı.Çapraz bağlı peptidler, C18 PepMap100 sorbenti ve 5 um PepMap sorbenti (Thermo Scientific) ile doldurulmuş 300 um ID'li, 5 mm uzunluğunda u-kolon öncesi C18 yakalama kolonunda toplandı.%2,5 AcN'de çözünmüş %0,08 trifloroasetik asit 5 ul/dk'ya ayarlanan pompa akışını yükleyin.Çapraz bağlı peptitler, iç çapı 75 μm ve uzunluğu 150 mm olan, 2 μm PepMap sorbenti (Thermo Scientific) ile doldurulmuş analitik erimiş silika kolonunda ayrıldı.Mobil fazlar A ve B, sırasıyla suda %0,1 FA ve asetonitrilde %0,1 FA'dan oluşuyordu.Gradyan %2,5 B'de başlar ve 90 dakikada doğrusal olarak %40 B'ye, ardından sonraki 2 dakika içinde %90 B'ye yükselir.Mobil faz bileşimi 10 dakika boyunca %90 B'de tutuldu ve daha sonra 2 dakika boyunca doğrusal olarak %2.5 B'ye düşürüldü.Sütun bir sonraki döngüden önce 8 dakika boyunca %2.5 B'de dengelendi.Analitik kolondan ayrıştırılan çapraz bağlı peptitler, bir nanoelektrosprey iyonizasyon (NSI) kaynağında iyonize edildi ve bir Exploris 480 kütle spektrometresine (Thermo Scientific) enjekte edildi.
Orbitrap Exploris 480 kütle spektrometresi pozitif veri korelasyon modunda çalıştırıldı.Bölüm modunda 120.000 çözünürlükte, m/z 350 Th ile m/z 2000 Th arasındaki aralık ayarlarıyla tam bir tarama gerçekleştirildi.Normalleştirilmiş AGC hedefi, maksimum 50 ms giriş süresiyle %300'e ayarlandı.Peptitler için monoizotopik tepe tespiti kurulmuştur.Çok az öncül bulunursa kısıtlama gevşetme parametresi doğru olarak ayarlanır.Öncünün minimum iyonik kuvveti 5.0e3'e ayarlandı ve +8'e kadar öncül yük durumları deneylere dahil edildi.
Veri korelasyon modunda ana taramalar arasındaki döngü süresi 2,5 saniyeye ayarlandı.Öncü iyonun ilk parçalanmasından sonra dinamik kütle dışlaması 20 saniyeye ayarlandı.Öncü izolasyon penceresi 2 Th'ye ayarlandı.Sabit bir çarpışma enerjisi moduna sahip normalleştirilmiş çarpışma enerjisi türü, veriye bağlı bir MS/MS taramasında seçildi.Çarpışma enerjisi %30'a ayarlandı.Orbitrap çözünürlüğü 15.000'e ve AGC hedefi %100'e ayarlandı.Özel maksimum enjeksiyon süresi 60 milisaniyeye ayarlanmıştır.
Çapraz bağlı numunelerde protein-protein ağını izlemeden önce, numunelerdeki izlenebilir peptitleri/proteinleri tanımlamak için MaxQuant paketini (versiyon 1.6.12.0)26,27 kullanarak ham dosyaları işledik.Ek olarak benzer proteomik analizler, IFNa ile tedavi edilen ve edilmeyen çapraz bağlanmamış Flo-1 numuneleri üzerinde gerçekleştirildi.MS/MS verileri, yerleşik Andromeda27 arama motoru kullanılarak UniProt insan veritabanında (www.uniprot.org) (12 Ağustos 2020'de yüklendi, 75.093 giriş içeriyor) arandı.Arama, enzimin spesifikliği ve çeşitli deamidasyon (N, Q) ve oksidasyon (M) modifikasyonları belirtilmeden gerçekleştirildi.Öncü kütle toleransları 20 ppm'ye ve ürün iyonları 0.02 Da'ya ayarlandı.Başlangıç ​​ve maksimum kütle sapması 10 ppm'ye ayarlandı.Peptitin maksimum kütlesi 4600 Da'ya ayarlandı ve dizi benzerliği 7 ila 25 amino asit (aa) arasına ayarlandı.Perseus programı (versiyon 1.6.10.45) kullanılarak daha ileri istatistiksel analizler yapıldı.Protein içeriği, proteinin spektral yoğunluğunun normalleştirilmesiyle hesaplandı (LFQ yoğunluğu; etiketlenmemiş nicelik)27 ve yoğunluk değerleri Log2'ye dönüştürüldü.Peptit yoğunluklarına göre tanımlanan proteinlerin hiyerarşik bir kümelenmesi, R (v 4.1.2)'deki pheatmap (v1.0.12) paketi kullanılarak oluşturuldu.Yol zenginleştirme analizi, işlenmemiş örneklerle karşılaştırıldığında dört kattan fazla aktive olan IFNa ile işlenmiş proteinler için Reactome yol veri tabanı kullanılarak gerçekleştirildi.
LC-MS/MS tarafından izlenen protein komplekslerinin lizin (K) veya serin (S) spesifik kimyasal çapraz bağlarının tanımlanması, çapraz bağlı peptitler (SIM-XL)29 için bir spektroskopik tanımlama makinesi (SIM-XL) kullanılarak gerçekleştirildi.İlk olarak, Padariya ve ark.28'de açıklanan IRDS protein veri seti kullanılarak interferonla ilişkili (IFN) DNA hasar direnç imzası (IRDS) genleri arasındaki olası etkileşimler araştırıldı.Tüm insan UniProt'unun tüm koşullarının ve tekrarlarının taranması hesaplama açısından yoğun olduğundan, IFNα ile tedavi edilen tekrarlara karşı tüm insan UniProt veritabanı (www.uniprot.org) (12 Ağustos 2020'de indirildi, 75.093 giriş içerir).Yüksek güvene sahip etkileşimlere yönelik filtrelerden biri.Elde edilen bu yüksek anlamlı etkileşimler genişletildi ve tüm tekrarlarda ve koşullarda test edildi.
SIM-XL'de çapraz bağlayıcı (XL) için DSS kullanıldı ve XL ağırlık kaydırması ve modifikasyon ağırlığı kaydırması sırasıyla 138.06 ve 156.07'ye ayarlandı.Aşağıdaki çapraz bağlanma reaksiyon bölgeleri dikkate alınır: raportör iyonları olmayan KK, KS ve KN-TERM.Hem öncü hem de parça ppm'si 20'ye ayarlandı ve Xrea eşiği 0,15'e ayarlandı.Tripsinin tamamen spesifik olduğu kabul edildi ve yüksek enerjili C-tuzağı (HCD) parçalanma yöntemi uygulandı.XCorr dinamik DB azaltma eşiği ve dinamik DB azaltma için minimum peptit sayısı sırasıyla 2,5 ve 2'ye ayarlandı.Diğer parametreler şunlardır: monoizotop olasılığı ve tepe çakışması kesme noktası, iplik başına minimum 4 AA kalıntısı ve maksimum iplik yükü ve kaçırılan bölünmelerin maksimum 3'ü.Ortaya çıkan birleştirilmiş 2B haritalar (SIM-XL)'de analiz edildi ve 2B haritaları oluşturmak için xQuest28 grafik gösterimi kullanıldı.Protein yapıları üzerindeki protein çapraz bağlantıları PyMol'de (PyMOL Moleküler Grafik Sistemi, versiyon 2.0 Schrödinger, LLC) sağlanmaktadır.
Protein modeli yapıları, homoloji modelleme ilkeleri ve "Gizli Markov Yöntemi"nin uygulanması kullanılarak Phyre2 sunucusu (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 kullanılarak oluşturuldu.Phyre2, bilinen protein yapılarıyla dizi hizalamasına dayalı model yapılar üretir.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 ve MDN1 proteinleri için 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 ve 6i2665 şablon yapıları kullanıldı.Ayrıca AlphaFold71 MX1, UBP18 ve ROBO1'in yapısı da dikkate alındı.Protein yapısı, BIOVIA Discovery Studio Visualizer paketi (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, ABD) ve Molecular Operating Environment paketi (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) kullanılarak görselleştirildi.